洋蔥總皂苷含量測定條件優化及其體外抗腫瘤活性研究*

樊孔明，蔡仁明，楊璐菡，姚秋艷，張世鵬，林 勇，楊春艷△

（1. 川北醫學院藥學院·川北醫學院藥物研究所，四川 南充 637100； 2. 川北醫學院基礎醫學創新研究平臺，四川 南充 637100； 3. 川北醫學院形態研究所，四川 南充 637000； 4. 川北醫學院臨床醫學系，四川 南充637000； 5. 川北醫學院公共衛生學院，四川 南充 637100）

洋蔥Allium cepaL. 為藥食兩用植物，含有皂苷、多酚、有機硫化合物等化學成分，具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗糖尿病、調血脂、抗高血壓、免疫保護等作用［1-10］，還具有促進人成纖維細胞增殖、誘導組織再生和促進傷口愈合的潛在藥理學活性［11］。皂苷的含量測定方法包括高效液相色譜法、比色法、薄層掃描法、原子吸收法等，其中比色法使用歷史悠久、應用較普遍［12-13］，其顯色體系主要包括香草醛-濃硫酸或高氯酸、鹽酸二甲氨基苯甲醛試劑、茴香醛試劑、對二甲氨基苯甲醛- 磷酸等［14］。目前，尚未見關于優化洋蔥總皂苷含量測定顯色條件的報道，洋蔥抗腫瘤活性的研究也鮮有報道。本研究中采用香草醛- 濃硫酸比色法，利用硫酸氧化皂苷與香草醛進行反應，通過單因素試驗確定了最佳顯色條件，并評價了該提取物對A549 細胞、HeLa 細胞、HepG2 細胞體外生長的抑制作用。現報道如下。

1 儀器、試藥與細胞

1.1 儀器

FA2004 型電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司，精度為0.0001 g）；HH-2k4型恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）；KQAQ 型中國超聲波專業清洗儀器（東莞市科橋超聲波設備有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；RE-52AA型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環水真空泵（河南金傅儀器制造有限公司）；AG - 9620A 型精密鼓風干燥箱（上海柏欣儀器設備廠）；N4型紫外分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；QE - 500 型粉碎機（武義縣屹立有限公司）；UPH - Ⅱ- 10T 型優普超純水制造系統（四川優普超純科技有限公司）；Multiskan Go 型全波長酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）；3111型CO2細胞培養箱（美國Thermo Forma 公司）；CDKX4 型熒光倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 試藥

紫皮洋蔥（市售）；薯蕷皂苷元對照品（批號為20210305，純度不低于98%），紫杉醇對照品（批號為20210316，純度不低于99%），香草醛對照品（批號為20210325，純度不低于98%），均購自北京索萊寶科技有限公司；Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM，批號為20210311），熱滅活胎牛血清（FBS，批號為20210316），0.25%胰酶- 乙二胺四乙酸消化液（批號為20210210），二甲基亞砜（DMSO，批號為20210115），均購自武漢博士德生物工程有限公司；CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號為20210402）；濃硫酸、冰醋酸均為分析純，購自成都市科隆化學品有限公司；95%乙醇（成都蜀都實業有限責任公司）；其他試劑均為分析純，水為自制超純水。

1.3 細胞

A549細胞（批號為20200108），HepG2細胞（批號為20200213），HeLa 細胞（批號為20200115），均由川北醫學院醫學影像研究所提供。

2 方法與結果

2.1 樣品及溶液制備

洋蔥粉末：取新鮮紫皮洋蔥，切片，置65 ℃烘箱中干燥至恒重，粉碎，于干燥器內保存，備用。

供試品溶液：取干燥后的洋蔥粉末800.0 g，加入64.5%乙醇［料液比為1∶10（m/V）］，54 ℃超聲提取3次，每次30 min，抽濾提取液，合并濾液，減壓濃縮，蒸干得提取物466.64 g（提取率為58.33%）。取上述醇提物0.5 g，精密稱定，加甲醇適量，超聲使溶解，轉移至100 mL 容量瓶中，加甲醇定容，即得質量濃度為5 mg/mL 的供試品溶液，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，分裝于15 mL 離心管，保存于4 ℃冰箱，備用。

對照品溶液：取薯蕷皂苷元對照品5 mg，精密稱定，加甲醇適量，超聲使溶解，轉移至5 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得質量濃度為1 mg/mL 的對照品溶液，保存于4 ℃冰箱，備用。

5%香草醛- 冰醋酸溶液：取香草醛對照品2.5 g，精密稱定，加冰醋酸適量，超聲使溶解，轉移至50 mL容量瓶中，加冰醋酸定容，保存于4 ℃冰箱，備用。

2.2 數據處理及分析

采用Excel 2013軟件統計并分析數據，采用GraphPad Prism 8.3.0 軟件和Adobe Photoshop CS4 軟件繪圖。所有試驗均平行測定3次，且至少重復2次。

2.3 最大吸收波長確定

分別精密量取2.1 項下洋蔥醇提物供試品溶液、薯蕷皂苷元對照品溶液和甲醇（空白對照）各0.1 mL，分別置試管中，80 ℃水浴揮干溶劑，冰浴條件下加入5%香草醛- 冰醋酸溶液0.2 mL 和80%硫酸0.8 mL，70 ℃水浴加熱15 min，冰浴10 min，轉移至5 mL容量瓶中，加冰醋酸定容，室溫靜置15 min［15］，于370 ～700 nm波長范圍內掃描。結果薯蕷皂苷元對照品溶液和洋蔥醇提物供試品溶液分別于455 nm 和470 nm 波長處有穩定的最大吸收峰，故最終確定檢測波長為455 nm。紫外吸收光譜圖見圖1。

2.4 單因素試驗優化顯色條件

精密吸取2.1項下供試品溶液0.1 mL，參考文獻［15］進行顯色反應。采用單因素試驗分別考察不同反應時間（5，10，15，20，25 min），不同反應溫度（60，65，70，75，80 ℃），不同5%香草醛- 冰醋酸用量（0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL），不同80%硫酸用量（0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL），不同冰浴時間（5，10，15，20，25 min）對洋蔥醇提物中總皂苷含量測定的影響。單因素試驗的固定值為反應時間15 min，反應溫度70 ℃，5%香草醛-冰醋酸用量0.2 mL，80%濃硫酸用量0.8 mL 和冰浴時間10 min。若有2個或以上因素對含量測定影響大，則采用響應面試驗進一步優化該顯色條件。結果見圖2。

由圖2 A 可知，供試品溶液的吸光度在反應時間不超過15 min 時明顯增大，反應時間超過15 min 時吸光度開始緩慢上升，故確定最佳反應時間為15 min。由圖2 B可知，供試品溶液的吸光度在反應溫度不超過75 ℃時明顯增大，反應溫度超過75 ℃時吸光度緩慢上升，故確定最佳反應溫度為75 ℃。由圖2 C 可知，供試品溶液的吸光度在5%香草醛-冰醋酸用量少于0.4 mL 時明顯增大，多于0.4 mL 時吸光度開始降低，故確定最佳5%香草醛-冰醋酸用量為0.4 mL。由圖2 D可知，供試品溶液的吸光度在80%硫酸用量為0.6 ～1.0 mL時明顯下降，故確定最佳80%硫酸用量為0.6 mL。由圖2 E可知，供試品溶液的吸光度在冰浴時間不超過20 min時明顯增大，超過20 min 時吸光度開始降低，故確定最佳冰浴時間為20 min。可見，對供試品溶液總皂苷含量測定影響大的因素只有5%香草醛-冰醋酸用量，故無需進一步利用響應面試驗優化顯色條件。因此，最終確定洋蔥醇提物中總皂苷含量測定的最佳顯色條件為使用5%香草醛- 冰醋酸0.4 mL 和80%硫酸0.6 mL，于75 ℃下反應15 min，冰浴20 min。

2.5 方法學考察［16-17］

線性關系考察：分別吸取2.1項下薯蕷皂苷元對照品溶液（質量濃度為1 mg/mL）30，40，50，60，70 μL，置試管中，按2.4 項下優選的顯色條件進行顯色反應，于455 nm 波長處測定吸光度，重復3 次，以對照品溶液質量濃度（C，mg/mL）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程A =61.317C -0.0287（R2=0.9957，n=5）。結果表明，薯蕷皂苷元對照品溶液質量濃度在0.006 ～0.014 mg/mL 范圍內與吸光度線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取2.1 項下供試品溶液適量，共6 份，于455 nm 波長處測定吸光度。結果的RSD為1.73%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取2.1 項下供試品溶液適量，在室溫下分別于顯色15，30，45，60，90，120 min 時，于455 nm波長處測定吸光度。結果的RSD為0.66%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置120 min內穩定性良好。

重復性試驗：取2.1項下洋蔥粉末適量，精密稱定，共6 份，按2.1 項下方法制備供試品溶液，于455 nm 波長處測定吸光度，并計算含量。結果洋蔥總皂苷的平均含量為73.44 mg/g，吸光度的RSD為3.53%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取2.1 項下洋蔥粉末1 g，精密稱定，共6 份，分別加入10 mg 薯蕷皂苷元對照品，按2.1項下方法制備供試品溶液，分別吸取供試品溶液和甲醇（空白對照）各50 μL，置試管中，按2.4項下優選的顯色條件進行顯色反應，于455 nm 波長處測定吸光度，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.6 抗腫瘤活性測定

樣品溶液制備：取洋蔥醇提物0.4062 g，精密稱定，置超凈臺內紫外照射消毒過夜，加DMEM 配制成質量濃度為32 mg/mL 的母液Ⅰ，4 ℃冰箱保存，備用；取紫杉醇對照品0.0020 g，精密稱定，加DMSO 配制成質量濃度為10 mg/mL的母液Ⅱ，4 ℃冰箱保存，備用。

細胞培養：HepG2細胞、A549細胞、HeLa細胞均使用完全培養基［DMEM-FBS-雙抗（89∶10∶1，V/V/V）］，于恒定37°C、5%CO2的細胞培養箱中培養。

細胞混懸液制備：取HepG2細胞、A549細胞、HeLa細胞，處于指數生長期時消化貼壁細胞，使用完全培養液將其制備為細胞混懸液。

分組與給藥：取指數生長期的HepG2細胞、A549細胞、HeLa 細胞，分別以3000 ～4000 個/孔的初始接種量接種于96孔板，每孔加入細胞混懸液100 μL，24 h后棄去培養液，藥物組分別加入質量濃度為9.6，8.0，6.4，4.8，3.2，1.6 mg/ mL 的洋蔥醇提物溶液（完全培養基稀釋2.6項下樣品溶液制備中母液Ⅰ配制而成）各100 μL，陽性對照組分別加入質量濃度為2.0000，1.0000，0.5000，0.2500，0.1250，0.0625 μg/mL 的紫杉醇溶液（完全培養基稀釋2.6項下樣品溶液制備中母液Ⅱ配制而成）100 μL，陰性對照加入完全培養基100 μL，每個濃度做3個復孔。

細胞活性測定：將96孔板置5%CO2、37 ℃培養箱中培養，分別于培養24 h和48 h時取出，棄去培養液，用磷酸鹽緩沖液清洗1 次，每孔加入CCK-8 溶液［DMEMCCK-8（10∶1，V/V）］110 μL，37 ℃培養1.5 h，使用酶標儀于450 nm 波長處測定吸光度（OD）［18-20］，按公式［抑制率（%）=（1-OD藥物組或陽性對照組/OD陰性對照組）×100%］計算抑制率。結果見圖3。由圖3 A和圖3 B可知，質量濃度為1.6 ～9.6 mg/mL 的洋蔥醇提物對HepG2 細胞、HeLa 細胞、A549 細胞的活性均有一定抑制作用，作用24 h 后對上述3 種細胞的半數抑制濃度（IC50）分別為4.463，7.126，3.964 mg/mL，作用48 h 后對上述3 種細胞的IC50分別為3.371，5.551，8.988 mg/ mL；由圖3 C和圖3 D 可知，質量濃度為0.0625 ～2.0000 μg/mL紫杉醇作用24 h 后對HeLa 細胞的生長抑制作用最強，作用48 h后對HepG2細胞的生長抑制率接近100%。

3 討論

3.1 洋蔥醇提物總皂苷含量測定方法選擇

甾體皂苷作為蔥屬植物中重要的活性成分，具有抗腫瘤、抗炎等作用［21-23］，其含量測定具有重要意義。但甾體皂苷只有較弱的末端吸收，目前主要采用比色法測定蔥屬植物的總皂苷含量［24］。如陳浩等［12］以硫酸-甲醇為顯色劑，采用比色法測定了大蒜提取物中總皂苷的含量。趙江瓊等［13］以薯蕷皂苷元為對照品，采用香草醛比色法測定了蔥白中總皂苷。LE 等［25］發現若反應溶液中存在丙酮、甲醇和正丁醇，采用香草醛-硫酸法測定會出現假陽性，故在反應前用80 ℃水浴揮干溶劑。本研究中以洋蔥醇提物中含有的薯蕷皂苷元為標準品，確定洋蔥醇提物總皂苷含量測定的最佳顯色條件。

3.2 洋蔥抗腫瘤活性研究

研究發現，洋蔥提取物對HepG2細胞［26-28］、HCT-116細胞［10］、Caco - 2 細胞［26］的增殖均有一定抑制作用。YANG 等［26］考察了美國地區不同種類的10種洋蔥的提取物對HepG2 細胞和Caco - 2 細胞的半數效應濃度（EC50），發現Western Yellow 洋蔥對HepG2 細胞的EC50為（61.9±2.10）mg/mL，New York Bold 洋蔥和Western Yellow 洋 蔥 對Caco - 2 細 胞 的EC50分 別 為（30.5 ±0.8）mg/ mL 和（32.0 ± 1.0）mg/ mL。通過激活半胱氨酸蛋白酶9內源性凋亡信號通路，從而發揮對HepG2 細胞的抑制作用，質量濃度為40 mL/ L 的洋蔥汁提取物處理48 h 后，細胞凋亡率為（28.3 ± 1.2）%［27］。本研究中發現，洋蔥醇提物不僅可抑制HepG2 細胞的增殖，還對HeLa細胞和A549細胞的增殖有一定抑制作用。

3.3 洋蔥總皂苷及其抗腫瘤活性

洋蔥中主要含有呋甾烷醇類和螺甾烷醇類甾體皂苷，包括吉托皂苷元、薯蕷皂苷元、β-chlorogenin、cepagenin、（25S）-ruscogenin 等苷元［7-10］。薯蕷皂苷可通過抑制腫瘤細胞的有絲分裂、誘導其凋亡發揮較好的抗腫瘤作用［6］。研究發現，洋蔥具有一定的抗腫瘤活性，提示可用于治療和預防腫瘤；而對于其抗腫瘤活性是多種有效成分（如皂苷、多酚、硫化物等）的協同效應，還是皂苷的個別效應，有待進一步深入研究。本研究中優選的洋蔥醇提物中總皂苷含量測定的顯色條件對于客觀評價洋蔥總皂苷的含量具有一定參考意義，可為洋蔥的質量控制和進一步開發利用提供參考。