基于分子對接技術的安宮牛黃丸治療新型冠狀病毒肺炎作用機制研究*

郭 倩，宋延平，喬 園，馬 力，趙林濤

（1. 陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712000； 2. 陜西省中醫藥研究院，陜西 西安 710000）

新型冠狀病毒的Spike（S）蛋白包含S1 和S22個亞 基，其中S1 亞基與宿主細胞膜表面受體血管緊張素換酶2（ACE2）結合，由S2 亞基來促進靶細胞膜的融合，共同促進病毒感染，進而導致ACE2 水平降低［1-3］。ACE2主要表達于心臟、血管、腎臟、胃腸道及肺泡上皮細胞中，具有舒張血管、降低血管通透性、抗增殖、抗氧化應激、抗血栓、保護心血管的作用［4］，是新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）病理途徑中的關鍵因子［5-6］。中醫藥歷史悠久，在預防和治療多種流行病中發揮了重要作用［7］。《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）——（七）中醫治療》中推薦COVID - 19 危重型患者服用安宮牛黃丸［8］。安宮牛黃丸由牛黃、水牛角濃縮粉、人工麝香、珍珠、朱砂、雄黃、黃連、黃芩、梔子、郁金、冰片等組方［9］，為中藥清熱開竅方“溫病三寶”之首，素有“救急癥于即時，挽垂危于頃刻”之美譽［10］。分子對接篩選技術是在現有生物結構的基礎上發現新配體的技術，篩選過程極大地縮小了人工方法進行配體活性篩選的研究范圍，并縮短了研究時間［11-12］。本研究中基于分子對接技術探討了安宮牛黃丸中的有效化學成分與ACE2結合的親和力及其治療COVID - 19 的作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 數據庫與軟件

數據庫：TCMSP 數據庫（https：// old. tcmsp - e.com/tcmsp.php）；PDB數據庫（https：//www.rcsb.org）。

軟 件：AutoDock Tools 1.5.6（https：// autodock.scripps. edu）；AutoDock Vina 1.1.2（http：//vina. scripps.edu）；PyMOL 1.7（http：//pymol.org）。

1.2 有效化學成分篩選

采用TCMSP 數據庫檢索安宮牛黃丸中中藥材的化學成分，剔除口服生物利用度（OB）低于30%和藥物相似性（DL）低于0.18的成分。在TCMSP 數據庫中下載成分的mol2 格式，將下載的成分導入ChemBioDraw Ultra 14.0 軟件，轉化為三維結構，并運行最低自由能。對于閱讀文獻補充的有效化學成分，采用ChemBioDraw Ultra 14.0軟件繪制化合物的結構，并轉化為三維結構，保存為mol2 格式，通過AutoDock Tools 1.5.6 軟件將格式轉換為pdbqt。珍珠、朱砂、雄黃主要含有金屬和有害元素，不進行分子對接。其中，珍珠主要成分為碳酸鈣及其他金屬元素，朱砂主要含硫化汞，雄黃主要含砷。

1.3 作用靶點選擇

從PDB 蛋白質數據庫（https：//www.rcsb.org/）下載ACE2（PDB ID：1R4L）的晶體結構，采用PyMOL 1.7軟件去除水分子及多余的氨基酸殘基，挖掘ACE2 蛋白晶體復合結構中的原配體XX5（即相應靶蛋白的抑制劑，與靶蛋白的結合活性良好），將挖掘后的1R4L 命名為1R4L_s，并將1R4L_s 及XX5 保存為pdb 格式，導入AutoDock Tools 1.5.6軟件，將格式轉換為pdbqt。

1.4 分子對接模擬

將1R4L_s、XX5 及成分在AutoDock Tools 1.5.6 軟件保存為pdbqt 格式，將XX5 原配體抑制劑的結合位置作為對接活性口袋。確定ACE2 活性位點的坐標為center_x = 40.199，center_y = 6.024，center_z = 29.006，size_x=15，size_y=15，size_z=15。除特別說明外，其他參數均采用默認值。選取對接結果打分值最高的構象，采用PyMOL 1.7 軟件繪圖。通過AutoDock Vina 1.1.2軟件運算得到安宮牛黃丸中101種化學成分與ACE2蛋白的對接結果。

2 結果

2.1 有效化學成分篩選

采用TCMSP 數據庫檢索獲得安宮牛黃丸中中藥材化學成分共561 個，將OB ＜30%且DL ＜0.18 的成分剔除，得到有效化學成分88 個，文獻補充13 個，最終納入101個。

2.2 有效化學成分對接

結合能小于0，說明配體與受體可自發結合，選取結合能不超過-5 kcal/mol 的化學成分作為有效化學成分。由表1 可知，安宮牛黃丸中101 個有效化學成分與AEC2 的結合能均低于- 5 kcal/ mol，與ACE2 結合較好。其中，對接結合能排名前3 的有效化學成分分別為baicalin，corchoroside A_qt，sudan Ⅲ。其分子對接圖見圖1。

表1 安宮牛黃丸中有效化學成分與ACE2的結合能Tab.1 Binding energy of active chemical components in Angong Niuhuang Pills and ACE2

續表1 安宮牛黃丸中有效化學成分與ACE2的結合能Continued Tab.1 Binding energy of active chemical components in Angong Niuhuang Pills and ACE2

2.3 對接結果

安宮牛黃丸與ACE2 親和力最好的3 個化學成分為黃芩中的baicalin（- 9.9 kcal/ mol）、黃連中的corchoroside A_qt（- 9.3 kcal / mol）、梔子中的sudan Ⅲ（-9.3 kcal/mol），上述3 個化學成分與XX5 的結合位點見表2，鍵合類型均為氫鍵。其中，baicalin，corchoroside A_qt，sudan Ⅲ在靶蛋白THR - 371 處以氫鍵的形式結合，baicalin與corchoroside A_qt在靶蛋白ASN-149處以氫鍵的形式結合。

表2 安宮牛黃丸中對接結合能排名前3的化學成分與XX5的結合位點對接結果Tab.2 Docking results of binding sites of XX5 and the chemical components which have the top three docking binding energy with ACE2 in Angong Niuhuang Pills

3 討論

COVID-19屬中醫“瘟疫”范疇，命名為“肺瘟”［13-14］，在疾病的危重期邪乘虛而入［15］。中醫具有整體觀念、陰陽平衡、辨證施治等特點，在調養身體和增強對流行性疾病的抵抗力方面，具有獨到見解和防治經驗，其在COVID-19的治療中發揮著重要作用［16］。

安宮牛黃丸主要功效為清熱解毒、芳香開竅，使邪火隨諸香一齊俱散。現代藥理學研究表明，其具有抗炎、抗病毒、提高機體免疫力等作用［17-21］，臨床常用于治療溫疫證屬熱入心包者。非典型性肺炎患者癥狀為邪勝正虛、內閉喘脫，用安宮牛黃丸聯合其他藥物治療，臨床療效確切［22］。在COVID-19的治療中，主要用于治療危重型證屬熱入心包者。

由本研究結果可知，采用TCMSP數據庫檢索獲得安宮牛黃丸中中藥材的化學成分共561個，篩選OB ＜30%且DL ＜0.18 的成分，得到有效化學成分88 個，文獻補充13個，最終納入101個。通過與ACE2（PDB ID：1R4L）進行對接，篩選出親和力最好的3 個成分為黃芩中的baicalin（- 9.9 kcal/ mol）、黃連中的corchoroside A_qt（-9.3 kcal/mol）、梔子中的sudanⅢ（-9.3 kcal/mol）。

ACE2屬腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAS）［23］，參與多種肺部疾病（如炎癥和纖維化）的調節，其正向調節途徑過度激活，能導致炎性反應、組織纖維化、氧化應激、細胞增殖和凋亡、動脈粥樣硬化等病理過程，造成多臟器損傷。Baicalin，corchoroside A_qt，sudan Ⅲ可能通過抑制RAS 的正向調節，起到抑制炎癥及組織纖維化等作用，減少對肺等臟器的損傷。

一般情況下，ACE2 可催化血管緊張素（Ang）Ⅱ直接降解形成Ang-（1-7），AngⅠ可產生Ang-（1-9），在ACE的作用下產生有血管舒張作用的Ang-（1-7）。Ang-（1-7）可降低ACE 的活性，且對ACE2 的活性無影響；Ang-（1-7）顯著提高了ACE2/ ACE 的活性比，可改善肺水腫和蛋白滲漏，減輕急性肺損傷；作用于Mas 受體，抑制RAS 的正向調控，從而發揮抑制炎性反應、抗增生、抗氧化應激等反向調節作用。嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）與宿主細胞受體ACE2結合，可觸發SARS-CoV-2-ACE2復合物進入靶細胞，導致ACE2 下調及Ang Ⅱ/ Ang -（1 - 7）比例上升，從而導致肺功能惡化和肺部損傷。Baicalin，corchoroside A_qt，sudan Ⅲ等成分可能通過誘導ACE2及Ang-（1-7）上調，促使AngⅡ下調，使AngⅡ/Ang-（1 - 7）比例降低、ACE2/ ACE 比例升高，進而減輕SARS-CoV-2對肺部的損傷。

AngⅡ的上調對肺部的損傷，還表現為促炎性因子（如白細胞介素6、腫瘤壞死因子-α 等）的釋放和免疫細胞的活化，誘導肺部炎性反應；可激活核苷酸氧化酶，大量作用于細胞膜的活性氧自由基被釋放，導致肺水腫及肺損傷［24］。炎癥與氧化應激相互作用，形成惡性循環［25］。Baicalin，corchoroside A_qt，sudan Ⅲ等成分可能通過抑制促炎因子表達而減輕炎性反應；也可能通過抑制核苷酸氧化酶的活性，使細胞膜脂質過氧化程度減輕，細胞膜通透性降低，從而使結構蛋白受損程度和胞內核酸反應程度減輕，最終導致肺部損傷減輕。黃芩中的活性成分baicalin具有抗炎、抗氧化、保護心肌缺血、免疫調節等藥理學作用，臨床可用于治療肺炎、呼吸道感染等疾病［26］。其通過抑制核因子-κB 的轉錄表達、干預炎性反應（如抑制白細胞介素2、白細胞介素6、腫瘤壞死因子-α的表達）及細胞凋亡過程，增強ACE2蛋白的表達［27-28］。

脫精氨酸9 緩激肽（DABK）是一種肺部炎性因子，其末端殘基可被ACE2 裂解，導致失活［29］。肺部ACE2活性的降低可導致DABK-B1受體軸的激活，氣道上皮細胞釋放促炎趨化因子，增加中性粒細胞浸潤，加劇肺部的炎癥和組織損傷［30-31］。SARS-CoV- 2 不僅具有致細胞病變效應和引起宿主的免疫病理反應，還阻斷了肺保護通路。Baicalin，corchoroside A_qt，sudan Ⅲ等成分也可能通過抑制DABK-B1受體軸的激活，抑制中性粒細胞浸潤，最終增強肺保護通路的作用。

治療COVID-19的中藥的化學成分中，關于baicalin的報道較多，corchoroside A_qt 和sudan Ⅲ幾乎未見報道。但清開靈制劑及黃連解毒湯等中藥復方中，黃連和梔子是2味重要的中藥，corchoroside A_qt及sudan Ⅲ在黃連和梔子及相關復方中的作用還值得挖掘。基于上述研究結果，推測安宮牛黃丸與ACE2 蛋白結合活性較強，具有治療COVID - 19 的潛力，可能通過黃芩中的baicalin、黃連中的corchoroside A_qt、梔子中的sudan Ⅲ促進ACE2 蛋白的表達及抑制RAS 的正向調節，導致Ang Ⅱ水平降低、Ang -（1 - 7）水平升高，起到舒張血管、減少血管及細胞膜的通透性、抗炎、抗氧化應激等作用。