銀翹散對(duì)急性肺損傷模型小鼠肺損傷的改善及作用機(jī)制*

王逸凡，楊居崩，趙顯芳，聶發(fā)龍，李秀芳

（云南中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室，云南 昆明 650500）

中性粒細(xì)胞是機(jī)體固有免疫防御系統(tǒng)的重要組成［1］。2004年，BRINKMANN 等［2］首次發(fā)現(xiàn)了中性粒細(xì)胞對(duì)抗感染的新方式，即形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）。NETs 由薄的染色質(zhì)纖維組成，包含髓過氧化物酶（MPO）、瓜氨酸化組蛋白H3（CitH3）、防御素、抗菌肽等30 種中性粒細(xì)胞蛋白［3］。受到促炎介質(zhì)、過氧化物等刺激后，中性粒細(xì)胞也可形成NETs［4］。在脂多糖誘導(dǎo)的新生小鼠急性肺損傷（ALI）模型中，支氣管肺泡灌洗液及NETs 的游離DNA 水平均升高，使用NETs 抑制劑脫氧核糖核酸酶（DNase）后，模型小鼠ALI 癥狀緩解，提示NETs 的產(chǎn)生可造成肺組織損傷［5］。銀翹散對(duì)病毒感染及由脂多糖誘導(dǎo)的小鼠ALI具有防護(hù)作用，可對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷，抑制白細(xì)胞介素6（IL - 6）、白細(xì)胞介素1（IL - 1）、腫瘤壞死因子- α（TNF- α）等炎性因子的釋放［6-7］。本研究中探討了銀翹散通過抑制NETs 的形成而改善脂多糖誘導(dǎo)的小鼠ALI 的作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：XS125A 型分析天平（瑞士普利賽斯公司，精度為十萬分之一）；Infinite M200 PRO 型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；cf16RX 型低溫高速離心機(jī)（日本Hitachi Koki 公司）；OSE-Y50 型高速組織研磨器（天根生化科技＜北京＞有限公司）；Ti-S型倒置相差顯微鏡、Ci-L型正置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；EG1150 型石蠟包埋機(jī)、RM2235 型手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)徠卡儀器有限公司）。

試藥：銀翹散組方藥材購自云南慈慧藥業(yè)有限公司，制備工藝參考文獻(xiàn)［8］；脂多糖（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)為O111：B4，批號(hào)為019M4009V）；兔來源抗CitH3 抗體（批號(hào)為GR - 13294584），兔來源抗MPO 抗體（批號(hào)為GR3243222 - 17），均購自英國(guó)Abcam 公司；DAPI 染料（批號(hào)為20200630），驢血清（批號(hào)為20200818），DNase I（批號(hào)為20200630），均購自北京索萊寶科技有限公司；異硫氰酸熒光素（FITC）山羊抗兔熒光抗體（批號(hào)為20000168），四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）山羊抗兔熒光抗體（批號(hào)為20000054），辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（批號(hào)為20000243），抗甘油醛- 3 - 磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號(hào)為00083126），均購自美國(guó)Proteintech Group公司。

動(dòng)物：健康雄性KM 小鼠，60 只，體質(zhì)量17～20 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SYXK（川）K2020 - 030，合格證號(hào)為51203500017366。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度18～22 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，明暗交替（12 h/12 h）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物倫理審查編號(hào)為R -06202009。

1.2 方法

分組、造模與給藥：按隨機(jī)數(shù)字表法將60 只KM 小鼠分為陰性對(duì)照組、模型組、銀翹散組、DNase Ⅰ組，各15 只。銀翹散組小鼠灌胃給予銀翹散（按生藥和體質(zhì)量計(jì)72.54 g/kg），陰性對(duì)照組、模型組、DNase Ⅰ組小鼠均灌胃給予等體積生理鹽水［9］，每天1 次，連續(xù)3 d。造模前均禁食不禁飲8 h。末次給藥30 min 后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，仰臥位固定于手術(shù)板上，頸部皮膚消毒，縱向切開，剝離皮下組織，暴露氣管，于氣管內(nèi)滴注脂多糖生理鹽水溶液（5 mg/kg），陰性對(duì)照組同法滴注等體積生理鹽水。隨后立即直立小鼠，上下輕度晃動(dòng)數(shù)次，使脂多糖均勻分布于肺部，DNase Ⅰ組小鼠滴注脂多糖10 min 后再同法滴注DNase Ⅰ（5 mg/kg），縫合傷口，待小鼠自然清醒［10-11］。

指標(biāo)觀察及檢測(cè)：1）肺濕/干重比（W/D）。模型復(fù)制6 h 后處死小鼠，無菌條件下迅速取出肺組織。取左肺上葉，準(zhǔn)確稱定質(zhì)量并記錄濕重（W），放入恒溫80 ℃干燥箱中烘烤72 h，稱定質(zhì)量，并記錄干重（D），計(jì)算W/D。2）肺組織形態(tài)。取右肺中葉，用10%多聚甲醛固定48 h，脫水，浸蠟，石蠟包埋，制成4 μm薄片，用蘇木精-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察。3）MPO 和CitH3 的表達(dá)水平。取右肺上葉，采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)MPO 和CitH3 的表達(dá)水平；取左肺中葉，采用免疫熒光法檢測(cè)MPO和CitH3的熒光表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)數(shù)資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊者采用LSD 法，方差不齊者采用Tamhane's法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織W/D

與陰性對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織W/D 顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，銀翹散組W/D 顯著降低（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組小鼠肺組織W/D比較（±s）Tab.1 Comparison of W/D of lung tissue of mice in each group（±s）

表1 各組小鼠肺組織W/D比較（±s）Tab.1 Comparison of W/D of lung tissue of mice in each group（±s）

注：與陰性對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05。圖3同。Note：Compared with those in the negative control group，*P ＜0.05；Compared with those in the model group，#P ＜ 0.05（for Tab. 1 and Fig.3）.

W/D 5.45±0.807.21±1.88*組別陰性對(duì)照組（n=14）模型組（n=13）W/D 6.12±1.11#6.03±1.53#組別銀翹散組（n=12）DNase Ⅰ組（n=9）

2.2 肺組織病理形態(tài)學(xué)變化

陰性對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，支氣管和血管周圍未見明顯炎性變化；模型組小鼠肺毛細(xì)血管通透性增高，肺部水腫，肺組織間隙可見大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞滲出；銀翹散組和DNase Ⅰ組小鼠肺組織病變均較模型組減輕，氣道周圍及肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。詳見圖1。

2.3 肺組織中MPO 和CitH3 免疫熒光表達(dá)

與陰性對(duì)照組比較，模型組小鼠MPO和CitH3的熒光表達(dá)水平均升高；與模型組比較，銀翹散組小鼠MPO和CitH3的熒光表達(dá)水平均下降。詳見圖2。

2.4 肺組織中MPO 和CitH3 的蛋白表達(dá)水平

與陰性對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織中MPO 和CitH3 表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，銀翹散組小鼠肺組織中MPO 和CitH3 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見圖3。

3 討論

ALI是由多種誘因引起的以急性、進(jìn)行性呼吸功能不全為特點(diǎn)的常見臨床危重癥，嚴(yán)重時(shí)表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）［12］。ALI/ARDS 由直接或間接的過度肺部損傷和全身性炎性反應(yīng)引起，其中NETs 發(fā)揮了重要作用［13］。新型冠狀病毒肺炎（COVID - 19）是由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的呼吸道疾病，可能發(fā)展為ARDS［14］。COVID-19 感染患者氣道腔內(nèi)的NETs，促進(jìn)血纖蛋白沉積和微血栓形成，阻塞肺泡和細(xì)小血管，導(dǎo)致氣管堵塞和肺通氣障礙［15］。COVID- 19 嚴(yán)重感染患者的肺中存在多個(gè)廣泛分布的NETs 浸潤(rùn)區(qū)域，NETs 通過促進(jìn)纖維細(xì)胞的分化，從而加重肺部纖維化［16］。中性粒細(xì)胞形成NETs，可增強(qiáng)其直接殺滅或間接干擾病原體擴(kuò)散的作用，阻止上呼吸道感染的進(jìn)一步發(fā)展。但過度激活的中性粒細(xì)胞在肺部形成大量的NETs，會(huì)直接加劇肺組織的損傷，推動(dòng)呼吸道感染的惡化進(jìn)程。

CitH3 的生成可反映NETs 水平。組蛋白瓜氨酸化后，核小體中組蛋白和DNA 間的緊密靜電結(jié)合被削弱，隨后DNA 骨架解螺旋，NETs 形成［17］。而組蛋白在體內(nèi)外均可對(duì)上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，加重ALI 癥狀［18］。MPO 可導(dǎo)致體外肺上皮和內(nèi)皮細(xì)胞死亡，表明MPO 對(duì)肺泡-毛細(xì)血管屏障有直接毒性作用［19］，其表達(dá)也可反映NETs 水平。本研究中模型組小鼠肺組織中NETs 水平較高，且肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，可能是NETs 中MPO 與CitH3 等對(duì)肺組織的損傷造成的。中醫(yī)認(rèn)為，ALI主要由肺部損傷以致肺失宣降、郁熱內(nèi)生，影響水液的輸布和排泄導(dǎo)致［20］。銀翹散主要由金銀花、連翹、桔梗、甘草、薄荷、牛蒡子等組方，具有疏散風(fēng)熱、辛涼宣散、清熱解毒、開宣肺氣、止咳等功效［21-24］。本研究結(jié)果顯示，銀翹散可緩解ALI 模型小鼠肺部炎癥的滲出和水腫，且小鼠肺組織中NETs 形成相關(guān)蛋白MPO 和CitH3表達(dá)水平均降低，提示銀翹散可能通過抑制NETs 的形成而減輕ALI，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。