間充質干細胞來源外泌體對視網膜光感受器細胞PI3K/AKT通路及Ang-1蛋白水平作用的研究

洪 博，崔 蓓，王鳳翔，田春雨，曹利群，秦利維，王麗君

常見的致盲性疾病有老年黃斑變性、糖尿病視網膜病變和視網膜色素變性。其中，老年黃斑變性和視網膜色素變性都屬于視網膜退行性病變，與視網膜中的神經細胞-光感受器細胞的損傷有關。我國在臍帶組織中分離出了探討間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)轉化為人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UCMSCs)，h UCMSCs具有分化潛力大、增殖能力強、免疫原性低、取材方便等特征，常用于治療糖尿病[1]、軟骨損傷疾病[2]。研究發現[3-4]，給糖尿病視網膜病變大鼠注射h UCMSCs可改善視網膜的功能及結構，同時還可降低血糖水平。存活細胞可分泌外泌體改變受體細胞的生理功能。相關研究證實[5]，h UCMSCs提取出的外泌體可自由穿梭進入卵巢癌細胞，并下調VEGF水平從而抑制新生血管生成達到抗腫瘤效果。另有研究證實[6]h UCMSCs外泌體對光損傷視網膜色素上皮細胞具有一定的治療作用。此外，在光損傷視網膜光感受器細胞的過程中，離不開信號通路及相關因子的參與。PI3K/AKT（磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B）通過調控下游因子水平，參與細胞生物學行為。研究表明，PI3K/AKT信號通路在增殖性玻璃體視網膜病[7]、青光眼[8]等多種眼科疾病的發生和發展過程中發揮關鍵作用；在高眼壓大鼠視網膜神經節細胞[9]、年齡相關性黃斑變性大鼠[10]光感受器細胞中為低表達。血管因子增加、出現微血管瘤等是造成糖尿病視網膜病變產生的較為基礎的病理變化，Ang-1與血管的再生長關系密切。Ang-1與Tie2結合可以阻滯細胞的凋亡，促進血管的穩定生長，保護血管防止其滲漏。但h UCMSCs外泌體在光損傷視網膜光感受器細胞中對PI3K/AKT通路及Ang-1蛋白的影響目前尚未完全了解。因此，本研究對MSC下外泌體對視網膜光感受器細胞PI3K/AKT通路及Ang-1蛋白水平的研究進行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 h UCMSCs購自武漢普諾賽生命科技公司，凍存備用。視網膜光感受器細胞株661W，購自上海奧陸谷生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 流式細胞儀（上海三歪醫療設備公司，型號：FACSVia）；透射電子顯微鏡（鄭州一品儀器公司，型號：JPX-1500）；CD63、CD90、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Ang-1一抗（中國碧云天生物科技公司）；辣根過氧化物酶二抗（北京索萊寶科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 h UCMSCs的復蘇 取出細胞凍存管，放入37℃水浴鍋內水浴3 min。75%酒精擦拭消毒凍存管后，吸出細胞懸液注入離心管中，補加少量含有10%PBS的DMEM培養液，離心半徑10 cm，800 r/min離心5 min，棄上清后常規培養，次日換液后常規培養。

1.2.2 h UCMSCs的傳代 觀察h UCMSCs貼壁生長至85%融合時，棄上清液，5 mL PBS液輕輕洗滌兩次。培養瓶中加入0.25%胰蛋白酶消化液2 mL，輕搖培養瓶使其均勻覆蓋瓶底，與細胞充分接觸，在恒溫培養箱中消化1 min，倒置顯微鏡下觀察，當細胞間隙增大，形態變圓時加入含10%FBS的DMEM培養液終止消化。吹打細胞使懸液均勻，取細胞懸液放入離心管中，離心半徑10 cm，800 r/min離心5 min后棄上清，加入2 mL 10%FBS的DMEM培養液重懸細胞，按1:2比例傳代，培養瓶中補充培養液至15 mL放入恒溫培養箱培養。

1.2.3 h UCMSCs外泌體的提取與電鏡觀察 取5~7代生長良好的h UCMSCs，按照細胞傳代方法，棄上清，常規PBS沖洗及胰蛋白酶消化后用含10%Exo-FBS的DMEM培養液培養48 h后，收集上清液，2 000×g離心30 min，去細胞碎片，經濾膜過濾到離心管中，4℃1 000×g離心70 min，得到外泌體濃縮液。將濃縮液移至離心管中，上述條件離心，收集底部沉淀，PBS稀釋，再次離心，洗滌，將外泌體濃縮液過濾除菌，于-80℃冷藏備用。按1:10的比例稀釋，取少量稀釋后外泌體液，于3%磷鎢酸溶液中染色5 min，透射電子顯微鏡觀察并拍攝照片。

1.2.4 視網膜光感受器細胞光損傷模型 將處于對數生長期的661W細胞消化后，接種于96孔板中培養24 h，在另一細胞培養箱中放人紫外線燈(radiant exposure=4.3 J/cm2)，將96孔板放在紫外線燈上10 cm處，照射10 min后關閉紫外燈，將96孔板移入沒有紫外線燈的細胞培養箱繼續培養。

1.2.5 h UCMSCs外泌體干預及分組 將細胞分為5組，正常組、光損傷組、低濃度組、中濃度組、高濃度組。正常組與光損傷組細胞常規培養，低、中、高濃度組在處理前24 h將光損傷視網膜光感受器細胞植入6孔板，當細胞生長融合至70%時，分別將25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL h UCMSCs外泌體添加到6孔板中與細胞共孵育48 h，加入PBS，收集細胞。

1.3 檢測指標

1.3.1 線粒體膜電位檢測 利用JC-1（5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide）檢測線粒體膜電位（DΨm）。向待檢測細胞內加入JC-1工作液后37℃避光20 min，JC-1稀釋緩沖液沖洗3次，激光共聚焦顯微鏡檢測。正常情況下，線粒體電位處于去極化狀態，JC-1在590 nm波長的發射光下呈現紅色點狀熒光，在凋亡細胞中，JC-1仍保持其單體狀態，530 nm波長的發射光為綠色彌散熒光。

1.3.2 免疫印跡檢測h UCMSCs外泌體表面標志蛋白CD63及CD90將外泌體樣品與5倍上樣緩沖液（含β-巰基乙醇）混合后，煮沸變性5 min，冰浴5 min。取30μg蛋白樣品上樣進行十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）變性，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳至目的蛋白有效分離。轉膜，脫脂奶粉封閉。將膜置于含對應小鼠抗人CD63及CD90單克隆抗體的Blotto溶液中，搖床上4℃輕輕搖動過夜。洗膜緩沖液洗滌后，將膜浸入含相應辣根過氧化物酶（horse reddish peroxidase，HRP）標記二抗的Blotto溶液中，室溫輕輕搖動2 h。ECL試劑盒檢測，顯影。

1.3.3 流式細胞儀檢測光損傷661W細胞凋亡 收集細胞（2×105/孔）接種于6孔板中，胰酶消化，完全培養基終止；PBS清洗，進行細胞計數，離心，離心半徑8 cm，1 250 r/min離心6 min，棄上清，混入500 μL Binding Buffer（結合緩沖液）重懸。加入5μL Annexin V-FITC混勻、10μL PI混勻，室溫避光孵育5~15 min，隨即進行流式細胞儀檢測。

1.3.4 免疫熒光檢測Ang-1取各組光損傷661W細胞，用預溫的1×PBS洗3次。4%的甲醛室溫固定20 min，0.2%Triton X-100透化5 min，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉30 min，加入抗Ang-1一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里，4℃過夜。加入二抗（用1%BSA稀釋），閉光孵育120 min。95%甘油封片，鏡下觀察。

1.3.5 免疫印跡檢測PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達 將光損傷661W細胞進行裂解并提取核蛋白,并對核蛋白的濃度進行測量,分裝后,保存在-20℃、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT一抗按1：500稀釋后孵育過夜，TTBS漂洗3次，每次10 min，最后加入辣根過氧化物酶二抗按1：2 000對溶液稀釋,常溫封閉。取出PVDF膜,每隔10 min漂洗1次，共3次，DAB顯色后照相，后計算其蛋白表達含量。實驗另設立抑制劑組（PI3K/AKT抑制劑LY294002）與激動劑組（PI3K/AKT激動劑740Y-P），實驗細胞處于對數生長期時用PBS緩沖液將INS-1細胞洗3遍，將細胞以數量為5×104接種于6孔板，培養24 h后用濃度為25 nM的740 Y-P以及40μmol/L的LY294002刺激INS-1細胞48 h，規范處理細胞進行下一步試驗。

1.4 統計學處理 應用GraphPad Prism 8.0軟件，實驗數據采用均數±標準差（）表示，均符合正太分布，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 h UCMSCs形態學 光鏡下見正常的h UCMSCs呈單層貼壁生長，細胞形態呈梭形、圓形或多邊形。細胞可成簇生長，胞內可見清晰核仁，部分細胞表現為雙核或多核。傳至5~7代后，細胞生長良好，活躍，可進行相關實驗，圖1。

圖1 h UCMSCs形態學A：h UCMSCs原代；B：h UCMSCs5~7代

2.2 h UCMSCs外泌體形態學 透射電鏡下可見h UCMSCs外泌體表現為一群類圓形的具有明顯膜結構的小囊泡，直徑在60~100 nm之間，囊泡內部可見低電子密度物質，圖2。

圖2 h UCMSCs外泌體形態學

2.3 h UCMSCs外泌體的表面特異性蛋白CD63及CD90結果顯示，h UCMSCs外泌體表達外泌體共性標志蛋白CD63及h UCMSCs特異性表面蛋白CD90，證實其來源可靠，圖3。

圖3 免疫印跡檢測h UCMSCs外泌體蛋白CD63、CD90表達

2.4 光損傷661W細胞模型形態學 照射10 min的紫外燈后，顯微鏡下可見細胞呈現出較為嚴重的皺縮，提示光損傷視網膜光感受器細胞模型建立成功，圖4。

圖4 光損傷視網膜光感受器細胞模型形態學

2.5 線粒體膜電位檢測 利用JC-1染色各組細胞并在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組線粒體膜電位情況，紅色顆粒狀熒光為主是正常細胞在DΨm較高時表現出來的，圖5A，而綠色熒光提示光損傷狀態下細胞凋亡增多、線粒體膜電位較低，JC-1單體形成進而表現為彌散的綠色熒光，圖5B，提示光損傷細胞模型建立成功。

圖5 光感受器細胞線粒體膜電位

2.6 流式細胞儀測凋亡 正常組（0.11±0.02）較光損傷組（9.73±0.82）細胞凋亡率低（t=28.730，P＜0.001）。光損傷組較低濃度組（5.24±0.42）細胞凋亡率低（t=11.940，P＜0.001）。低濃度組較中濃度組（3.17±0.29）細胞凋亡率低（t=9.934，P＜0.001）。中濃度組較高濃度組（0.25±0.03）細胞凋亡率低（t=24.530，P＜0.001），圖6。

圖6 各組細胞凋亡率比較

2.7 免疫熒光檢測Ang-1熒光顯微鏡下，DAPI將細胞核染成藍色，以辣根酶標記的二抗將Ang-1蛋白染成紅色。光損傷組表達明顯強于正常組，低濃度組Ang-1表達稍有減弱，但不明顯，中濃度組表達有明顯的下降，而高濃度組的Ang-1表達下降更明顯，僅僅稍強于正常組，圖7。

圖7 不同濃度h UCMSCs外泌體作用后Ang-1的表達

2.8 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達 正常組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平高于光損傷組（P＜0.05），光損傷組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平低于低濃度組（P＜0.05），低濃度組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平低于中濃度組（P＜0.05），中濃度組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平低于高濃度組（P＜0.05），高濃度組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平與激動劑組比較無差異（P＞0.05），抑制劑組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平低于模型組（P＜0.05），表1，圖8。

圖8 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平比較

表1 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平比較（±s）

表1 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT水平比較（±s）

與正常組比較aP＜0.05；與光損傷組比較bP＜0.05；與低濃度組比較cP＜0.05；與中濃度組比較dP＜0.05；與高濃度組相比eP＜0.0；與抑制劑組相比fP＜0.05

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3 討論

高強度的光照會引起視網膜光感受器細胞的凋亡，加快視網膜退行性疾病的進展，導致不可逆的視力損害。本研究證實提取出的h UCMSCs外泌體可用于后續實驗，過程與何廣輝[11]等的鑒定一致。為了進一步研究h UCMSCs外泌體對光感受器細胞的作用，本研究采用體外培養的紫外線誘導661W細胞損傷模型[12]，結果顯示，在紫外線照射培養的661W細胞10 min后，給予h UCMSCs外泌體干預，與光損傷組相比,隨著濃度的增加，可顯著減少光損傷視網膜光感受器細胞凋亡，從而對光損傷視網膜起保護作用，提示h UCMSCs蛋白對紫外線照射誘導661W細胞損傷模型有神經保護作用。馬明明[13]等提示，h UCMSCs外泌體可抑制視網膜脫落的大鼠炎癥反應及光感受器細胞凋亡。本研究與上述研究結果相似。

PI3K激活誘導Akt磷酸化調節對視網膜和中樞神經損害的神經保護作用已有報道[14]。PI3K被激活后通過生成磷脂產物激活AKT進而干擾線粒體細胞色素C釋放，抑制細胞凋亡。相關研究發現[15]β-雌二醇可激活PI3K/AKT信號通路而抑制Bax參與的線粒體凋亡途徑而保護視網膜神經細胞。另有研究提示[16]，上調老年性黃斑變性視網膜色素上皮細胞PI3K/AKT通路，可降低細胞氧化應激損傷，發揮細胞保護作用。本研究結果顯示，在經h UCMSCs外泌體干預后，p-PI3K、p-AKT蛋白水平升高，且呈現出明顯的劑量依賴性。因此，推測h UCMSCs外泌體可能通過激活PI3K/AKT通路，抑制了視網膜光感受器細胞的凋亡。王輝[17]等研究提示，二十二碳六烯酸通過激活PI3K/AKT通路抑制年齡相關性大鼠光感受器細胞凋亡。劉輝[18]等研究提示，在h UCMSCs外泌體通過調控PI3K-AKT通路抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡。本研究與上述研究結果相似。

在眼底新生血管發生后，視網膜色素上皮層屏障被破壞，從而使血管滲漏，損傷光感受器細胞。Ang家族及其受體Tie2系統在血管的發育成熟與穩定、調控血管完整性方面具有重要意義。Ang-1不僅刺激內皮細胞增殖和遷移，從而促進新生血管生成，它還能起到破壞視網膜色素上皮層屏障的作用。Ang-1通過與Tie2受體結合后激活PI3K／AKT信號通路發揮對血管的發育成熟與穩定、抑制滲漏等重要作用。雷潤佳[19]等研究發現，降低Ang-1水平后，通過與Tie2受體結合后激活PI3K/AKT信號通路發揮抑制血管滲漏等作用。楊梓超[20]等研究提示，通過下調糖尿病視網膜病變大鼠Ang-1表達，改善視網膜光感受器細胞層結構，減少細胞水腫等從而改善視網膜組織病變。本研究中免疫熒光結果顯示，與正常組比較，光損傷組Ang-1的表達增加，給予h UCMSCs外泌體干預后，隨著濃度的增加，Ang-1的表達逐漸降低，這提示h UCMSCs外泌體具有抑制血管滲漏的作用。

綜上所述，間充質干細胞下外泌體可能是通過激活PI3K/AKT通路，抑制了視網膜光感受器細胞的凋亡以及Ang-1的水平，從而對光損傷視網膜起保護作用。