Mi R-32-3p在多發性骨髓瘤中的表達及其臨床意義

石 林，張帥帥，任翠愛

多發性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一種好發于中老年人的惡性漿細胞腫瘤，約占血液系統惡性腫瘤的10%，發病率僅次于非霍奇金淋巴瘤。隨著新型藥物的引入，患者的總體生存率得到明顯改善，5年相對存活率從1973-1982年的28%增加到2003-2013的41%[1]，但由于耐藥性的存在，大多數骨髓瘤患者仍無法擺脫復發的厄運[2]。

MicroRNA（miRNA）是長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，可以通過靶向mRNA沉默mRNA的翻譯或促進mRNA降解[3]。miRNA可以調節人體內約30%～80%的mRNA轉錄水平，通過調節轉錄后基因的表達控制細胞的增殖、分化、遷移以及凋亡[4]。miR-32-5p已被證實在多種腫瘤中高表達，在多發性骨髓瘤中，過表達miR-32-5p的骨髓瘤細胞系，細胞周期蛋白c-Jun,c-Myc表達也隨之增高[5]，表明miR-32-5p在多發性骨髓瘤中作為致癌因子發揮作用[6]。但是對于miR-32-3p在多發性骨髓瘤中作用幾乎沒有相關報道。miR-32-3p作為染色體不穩定相關micRNA，可能會影響MM的發生發展。為了研究miR-32-3P在MM患者中發揮的作用以及對藥物的敏感性的影響，本次實驗收集了中國醫學科學院血液病醫院淋巴瘤診治中心就診的26例骨髓瘤患者標本，8例健康供者的骨髓標本，與健康患者比較，miR-32-3p在骨髓瘤患者中呈現低表達狀態，提示miR-32-3p可能在骨髓瘤中發揮著抑癌作用。

1 材料和方法

1.1 骨髓瘤樣本收集及處理 收集中國醫學科學院血液病醫院淋巴瘤診治中心2014年6月-2014年12月就診的26例骨髓瘤患者標本（實驗室檢驗后廢棄樣本），8例健康供者的骨髓標本（實驗室檢驗后廢棄的骨髓移植的健康供者標本），兩組標本年齡、性別具有可比性。所有樣本經淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，使用80μL PBS-AB重懸2×107/mL的細胞懸液，加入20μL CD138磁珠，4℃孵育5 min，過柱分離出CD138+細胞，-80℃保存備用。

1.2 骨髓瘤細胞系（ARP1）培養與轉染 將生長狀態良好的ARP1細胞以2×106/孔接種于10 cm培養皿中，使用Lenti-PacTM HIV慢病毒包裝試劑盒（Genecopia，LT001-01,LT001-03），使用miR-32模擬物和miR-control質粒轉染ARP1野生型細胞,分別記做ARP1-miR-32 OE和ARP1-EV，同時加入polybrene 3μg/mL，轉染24 h后換液，用RPMI1640培養基（含10%FBS+1%雙抗）培養2 d后，在熒光顯微鏡下觀察熒光情況，使用嘌呤霉素（puro）1μg/mL篩選細胞，流式檢測陽性率，陽性率在90%以上為最佳。

1.3 PCR驗證轉染細胞miR-32-3p的表達豐度 使用All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒（Genecopia，QP015），以U6（Genecopia，HmiRQP9001）為內參,用實時定量PCR檢測ARP1-miR-32OE和ARP1-EV2個細胞系miR-32-3p（Genecopia，HmiRQP0403）的表達豐度。以2-ΔΔCt計算miR-32-3p的相對表達量，重復3次，取平均值。

1.4 細胞增殖實驗 取對數生長期的ARP1-EV和ARP1-miR-32 OE細胞，調整濃度為1×105/mL，在12孔板中鋪板，每孔加入2 mL細胞懸液，使每孔起始細胞數為2×105個，設3個復孔。分別在d 2、3、4、5、6、7記錄細胞數據。

1.5 藥敏試驗 CCK8檢測miR-32-3p對細胞化療耐藥性影響，取對數期生長的ARP1-miR-32-3P-OE與ARP1-EV細胞，細胞密度調整為5×105/mL，每孔取100μL，接種于6孔板中；設置化療藥物硼替佐米濃度為5 nmol/L，每孔加如10μL，設3個復孔。在37℃、5%CO2的培養箱中,分別孵育24、48、72 h，加CCK8溶液10μL/孔，2 h后使用用酶標儀檢測在450 nm處的吸光度。實驗重復3次，計算細胞存活率。細胞存活率=實驗孔平均吸光度/對照孔平均吸光×100%,。

1.6 Western blot驗證細胞周期相關蛋白表達量將ARP1-EV細胞以及ARP1-miR-32 OE的細胞裂解，BSA定量法測定蛋白濃度，上樣量調整為每孔20μL進行蛋白電泳，轉膜；用5%的脫脂奶粉封閉1 h，洗膜，分別用c-Myc（Proteintech，10828-1-AP），Aurka（Abcam，ab13824），p53（Abcam，ab131442），p-H2AX（CST,#9718）等細胞細胞周期相關抗體，4℃冰箱孵育過夜，洗膜，室溫孵育相應二抗1 h后洗膜，在化學發光成像儀（Biorad，chemiDoc）中進行顯色，用灰度值表示個蛋白相對表達量。

1.7 動物體內實驗 小鼠(NOD-SCID)雌性小鼠（10只），購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（動物質量合格證號SCXK（京）2016-0006），在中國醫學科學院血液學研究所SPF級動物合格環境下飼養（合格證號SYXK（津）2020-0003），適應性飼養1周后（6周齡，體重為18～20 g），隨機分為2組，每組5只，共10只小鼠，將對數生長期的ARP1-EV細胞、ARP1-miR-32OE細胞離心，PBS清洗兩遍，重懸，細胞濃度調制1×107/mL，小鼠腋下注射100μL細胞懸液（1×106個細胞），對照組接種ARP1-EV細胞，實驗組注射ARP1-miR-32OE細胞，成瘤后使用游標卡尺測量腫瘤長徑（a），短徑（b），計算腫瘤體積V（cm3）=a×b2／2，當腫瘤長徑超過2 cm時脫頸處死小鼠，剝離腫瘤組織。

1.8 統計學處理 使用GraphPad Prism8.0.1進行圖片繪制。采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，計量資料均以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，重復測量資料使用方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨髓瘤患者與健康供者miR-32-3p的相對表達水平 骨髓瘤患者26例，男15例，女11例，年齡（53.1±9.7）歲，健康供者8例，男5例，女3例，年齡（43±6）歲。骨髓瘤患者骨髓CD138+細胞miR-32-3p的表達水平（7.33±6.17）低于健康供者骨髓CD138+細胞miR-3-3p的表達水平（40.49±27.97，P＜0.001）（圖1）。

圖1 Mir-32-3p在健康供者與骨髓瘤患者樣本中的表達水平

2.2 RT-PCR檢測細胞轉染效率 RT-PCR檢測miR-32-3p過表達水平為（12.11±0.32）倍（P＜0.01），差異具有統計學意義（圖2）。細胞絕對計數法檢測ARP1-miR-32OE/EV細胞的增殖情況，與對照組比較，過表達miR-32-3p的MM細胞系能明顯抑制細胞增殖（P＜0.01，圖3）。

2.3過表達miR-32-3p對MM細胞增殖的影響 用

圖3 過表達miR-32-3p對MM細胞增殖的影響

2.4 ARP1-miR-32-3p-OE細胞系對化療藥物耐藥性的影響 在抗癌藥物硼替佐米的作用下，ARP1-EV細胞系存活率均高于同時點的ARP1-32-3p-OE細胞系（P＜0.05)。表1。

表1 ARP1-miR-32-3p-OE細胞系對化療藥物耐藥性的影響（±s）

表1 ARP1-miR-32-3p-OE細胞系對化療藥物耐藥性的影響（±s）

與同時點ARP1-EV細胞比較，*P＜0.05

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2.5 WB實驗結果 免疫印跡實驗結果顯示，miR-32-3p在蛋白水平下調c-Myc，Aurka，Bcl2，Notch1的表達，上調p-53，p-H2AX表達（圖4,表2）。

表2 Mir-32-3p對ARP1細胞系相關蛋白的影響

圖4 WB實驗結果

2.6 MiR-32-3p表達水平對MM細胞體內增殖的影響 ARP1-miR-32-3p OE組小鼠腫瘤體積（V3=5.33±2.13cm3）與ARP1-EV組腫瘤體積（V3=9.40±4.29cm3）比較，增殖受抑制，（P＜0.05，圖5）。

圖5 MiR-32-3p表達水平對MM細胞體內增殖的影響(A)ARP1-miR-32-3pOE細胞系腫瘤生長速度；(B)小鼠腫瘤體積大小直觀圖

3 討論

多發性骨髓瘤是血液系統中發病率僅次于非霍奇金淋巴瘤的惡性腫瘤[7]，由于復雜的骨髓微環境以及高度的侵襲性，多發性骨髓瘤的發病機制至今未被完全了解，隨著新藥的不斷開發，多發性骨髓瘤患者的5年相對生存率得到明顯改善，然而，頻繁的復發與耐藥仍然是大多數患者無法避免的結局[8]。因此，尋找MM潛在靶向因子，有望為臨床疾病治療提供新的思路與靶標。

MicroRNA顯示出了其在生命過程中的調控能力[9]，研究顯示，miRNA多出現在染色體缺失或擴增的不穩定區域，與癌癥的發生密切相關，已被證實多種miRNA可以調控MM的發展，miR-15a與miR-16在MM顯著低表達，并與Bcl2和Cyclin E的表達呈負相關[10]，通過影響CDC25A和Cyclin D1/D2表達，靶向Bcl2并抑制AKT3和NF-kB途徑來抑制細胞增殖；miR-221和222通過靶向腫瘤抑制基因PTEN和與促凋亡基因PUMA，發揮致癌作用[11]；miR-138可以抑制TRPS1和SULF2的表達，抑制miR-138的表達增強了MM的骨生成[12]。本研究結果顯示，miR-32-3p相較于正常樣本，在骨髓瘤患者體內顯著低表達，并且能夠下調c-Myc，Bcl2等蛋白的表達，抑制MM細胞的增殖。

為了探索ARP1-miR-32-3p在藥物敏感性方面發揮作用的機制，本研究檢測了與耐藥增殖等相關的蛋白。c-Myc基因是位于染色體8q24.21的原癌基因，編碼一種核磷蛋白，在細胞周期，凋亡和細胞轉化中起到作用，編碼的蛋白質與相關轉錄因子MAX形成異源二聚體結構[13]。該基因的易位常發生在伯基特淋巴瘤[14]和多發性骨髓瘤[15]。研究發現，c-Myc過表達會激活相關下游基因的表達，促進DNA合成，介導細胞周期延長，增加染色體畸變率，導致基因組不穩定并產生化療藥物抵性?，F有研究證實，c-Myc在急性髓系白血病等多種腫瘤中過表達，并與細胞的耐藥性有關。Aurka編碼的蛋白質是調節細胞周期的一種激酶，在染色體分離過程中參與紡錘體極的形成與穩定過程[16]。研究發現，在MM中影響染色體不穩定與DNA損傷，并參與腫瘤細胞耐藥[17]。Bcl2蛋白是調節蛋白Bcl2家族成員，Bcl2的異常表達可以破壞MM中的正常的凋亡途徑，且為MM患者耐藥的重要[18]；Notch通路是一條高度保守的信號轉導通路，參與細胞的增殖，分化與凋亡。研究表明，Notch信號通路與多發性骨髓瘤的發病與進展密切相關，Notch1的激活可以促進MM細胞增殖[19]，抑制MM細胞凋亡，促進腫瘤細胞耐藥性[20]。本研究結果顯示，miR-32-3p均可明顯下調上述蛋白的表達，表明miR-32-3p可以抑制MM細胞的增殖，促進MM細胞凋亡，加強了對硼替佐米的敏感性。

早期有關microRNA命名較為混亂，許多實驗并未明確指出所研究miR-32的是來自miR-32前體（pre-miR-32）的5’端還是3’端，由于腫瘤細胞的異質性和所處微環境的不同，不同腫瘤中microRNA的5’端和3’端表達豐度可能會存在差異。目前有關miR-32的報道多數集中于肝癌[21]，結腸癌[22]（miR-32），前列腺癌[23]，腎癌[24]（pre-miR-32）等。MiR-32在這些癌細胞中均表現出高表達。而對于miR-32-3p報道，在一項胸膜間皮瘤的研究中明確顯示miR-32-3p表達升高，在鼻粘膜息肉的研究中miR-32-3p的表達下調[25]，而有關卵巢癌的研究中顯示出miR-32的下調，且高表達miR-32能明顯抑制卵巢癌細胞的增殖[26]。

miR-32位于染色體9q31.3，越來越多的研究顯示MM疾病的發生與9號染色體異常有關[27]，因此可以推測可能是9號染色體的異常使得miR-32-3p的表達降低。此次實驗，miR-32-3p在多發性骨髓瘤中抑制腫瘤生長的作用已得到驗證，然而miR-32-3p的具體作用機制尚不明確，miR-32-3p是否受其他蛋白或LncRNA調節，是否參與了MM經典通路，miR-32-3p的靶基因都有哪些等還需做進一步的研究與驗證。

目前對miR-32-3p的研究較少，尚未有關于miR-32-3p在多發性骨髓瘤中研究的相關報道，此次對miR-32-3p的研究顯示出了較好的陽性結果，提示miR-32-3p可能是多發性骨髓瘤的一個潛在抑癌因子，可能通過調節細胞周期進程，促進細胞衰老，增加對抗癌藥物的敏感性，來抑制多發性骨髓瘤的發展。有望成為治療多發性骨髓瘤的新的靶點，同時為研究多發性骨髓瘤提供新的方向。