基于外周血免疫學特征的鼻咽癌初診遠處轉移風險評估模型構建

陳思皓 何淑婭 邵世龍 何姍珊 王東生 楊牧 張石川

鼻咽癌起源于鼻咽黏膜，是上皮腫瘤中較為少見的與Epstein-Barr（EB）病毒感染相關的惡性腫瘤，東南亞地區與中國華南地區是高發區[1]。放療聯合化療作為目前鼻咽癌的一線治療方案，能有效控制其進展，無轉移患者5年生存率可達80%以上[2]。但初診時4%～10%、治療隨訪期間10%～15%的鼻咽癌患者發生遠端器官轉移[3]，生存時間僅為9～20個月[4]。如何對這部分患者進行早期診斷，拓寬治療窗口，從機制上厘清鼻咽癌演進的異質性，是目前本領域臨床診療探索所面臨的主要挑戰。

EB病毒感染是鼻咽癌發生的重要因素之一。通過與EB病毒感染的正常人群比對發現，BALF2_CCT等病毒亞型不僅具有較高的擴散率與致突變率進而導致鼻咽癌的發生[5]，同時其慢性感染還能改變宿主免疫系統，尤其是T淋巴細胞亞群與功能，從而導致宿主免疫背景發生特異性改變[6]。另外，由于鼻咽部存在大量淋巴循環以及復雜的次級免疫結構，鼻咽癌的發生和進展往往伴隨大量的免疫細胞浸潤。而這部分浸潤免疫細胞通過咽淋巴環和引流淋巴結游離至循環系統，改變外周免疫細胞亞群數量以及比例，可能形成特殊的免疫特征。

本研究以初診且接受流式細胞檢測的鼻咽癌患者為研究對象，納入治療前免疫細胞亞群及計數、中性粒細胞與淋巴細胞比例（neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）、淋巴細胞與單核細胞比例（lymphocyteto-monocyte ratio，LMR）、血小板與淋巴細胞比例（platelet-to-lymphocyte ratio，PLR）以及乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、預后營養指數（prognostic nutritional index，PNI）、血漿EB病毒載量、臨床分期等既往報道的預后因素[7-9]，對遠處轉移風險進行多維度評估，嘗試建立以臨床可及檢查手段為基礎的初診遠處轉移風險評估模型，輔助此部分患者早期診斷，為臨床創造提前干預的窗口。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性收集2019年1月至2021年6月于四川省腫瘤醫院確診并接受外周血淋巴細胞亞群分析的初診鼻咽癌患者231例。本研究獲得本院醫學倫理委員會的批準（審批號：SCCHEC-02-2019-10）。

1.2 方法

1.2.1 納入標準 1）于本院病理確診且未接受任何治療的鼻咽癌患者，腫瘤細胞原位雜交EBER（+）；2）KPS評分≥70分；3）有完整的初始臨床病例資料；4）無免疫系統相關疾病且既往未經免疫治療；5）無活動期急慢性傳染性疾病；6）未進行任何抗腫瘤治療。

1.2.2 外周血免疫學指標和臨床特征收集 包括患者性別、年齡、吸煙史、飲酒史、血漿EBV DNA拷貝數、血常規指標（中性粒數目、淋巴細胞數目、單核細胞數目、血小板數目）、生化指標（LDH、白蛋白）、外周血淋巴細胞亞群百分比及絕對值[CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、CD19+B細胞、CD（16+56）+NK細胞]，計算NLR、LMR、PLR以及PNI指數。

1.2.3 遠處轉移診斷標準 入組患者根據美國癌癥聯合會（AJCC）第8版進行重新分期，根據初診是否存在遠處轉移分為轉移組和非轉移組，進行臨床和免疫指標與轉移的關聯性分析。遠處轉移診斷標準：肝轉移的診斷標準為組織活檢證實，或超聲、CT、MRI任何兩項，或PET/CT一項影像學提示轉移；骨轉移為活檢病理證實，或骨掃描、核磁、CT任意兩項，或PET/CT一項提示轉移；肺轉移為活檢病理證實，或PET/CT一項，或胸部CT需由兩位高年資影像醫師一致考慮為轉移。

1.2.4 遠處轉移分層標準 本研究根據患者轉移負荷嚴重程度分為輕度轉移和重度轉移，分別檢驗風險預測模型的有效性。輕度轉移定義為單個器官轉移，且所有轉移灶直徑之和<3 cm；重度轉移定義為多器官轉移或所有病灶直徑之和≥3 cm。

1.3 統計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行單因素及多因素分析，列線圖模型構建及性能檢驗使用R 4.1.1軟件和RMS程序包，圖形繪制采用GraphPad Prism 8.0軟件。所有檢驗均為雙尾檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

采用受試者工作特征曲線（ROC曲線）中的曲線下面積及最佳約登指數確定各連續變量資料的截斷值，以此分為高值組和低值組。計數資料采用百分數表示，用χ2 Test或Fisher′s Exact Test進行單因素分析。將單因素分析中P<0.05的指標進一步納入多元Logistic逐步回歸法分析，從而確定初診遠處轉移患者的獨立相關因素。基于多因素分析篩選出的指標構建可視化列線圖預測模型。使用Bootstrap重抽樣法對列線圖預測模型進行內部驗證，重復取樣次數1 000次。采用一致性指數（C-index）、ROC曲線下面積（AUC）、臨床決策曲線（DCA）以及臨床影響曲線（CIC）進一步分析列線圖性能，并使用Calibration校正曲線來描述列線圖的符合度。根據模型預測概率分為高、中、低危三組，驗證各分期患者危險分組的分布情況。

2 結果

2.1 患者的臨床特征

本研究共納入231初診鼻咽癌患者，其中男性163例，女性68例，男女比例為2.4∶1，中位年齡50.5（18～71）歲。血漿EBV DNA拷貝數陽性標準為400拷貝/mL，其中<400拷貝/mL為141例（61.1%），≥400拷貝/mL為90例（38.9%）。根據治療前各項輔助檢查明確已發生遠處轉移患者48例，未發生遠處轉移患者183例。48例轉移患者中，骨轉移20例，肺轉移9例，肝轉移6例，骨轉移合并肺轉移6例，骨轉移合并肝轉移4例，肝轉移合并肺轉移3例（表1）。

表1 231初診鼻咽癌患者的臨床特征

2.2 轉移發生風險的單因素及多因素分析

單因素分析表明，EBV DNA拷貝數、N分期、CD4/CD8比值、B細胞百分比、NK細胞百分比、CD4+T細胞絕對數、B細胞絕對數、NK細胞絕對數、LDH、NLR、PNI以及LMR與初診遠處轉移患者有關（均P<0.05，表2）。由于CD4/CD8比值是由CD4與CD8簡單運算得出，存在顯著的共線性，故僅將CD4/CD8比值納入多因素分析。多因素Logistic回歸分析最終篩選出N分期、CD4/CD8比值、NK細胞絕對數、LDH以及PNI是初診遠處轉移患者的獨立相關因素（均P<0.05，表3）。

表2 兩組患者臨床及免疫學特征比較

表2 兩組患者臨床及免疫學特征比較 （續表2）

表3 初診遠處轉移患者的多因素Logistics分析

表3 初診遠處轉移患者的多因素Logistics分析 （續表3）

2.3 遠處轉移風險評估模型的建立及評價

根據多因素篩選結果建立預測模型，并以可視化列線圖展示（圖1）。通過Bootstrap法重抽樣1 000次，對列線圖進行內部驗證得到C-index為0.826。ROC曲線分析表明AUC值為0.826，模型的總體準確度較高（圖2B）。Calibration校正曲線顯示列線圖預測的概率與實際概率基本一致（圖2A），提示建立的列線圖模型可以以較高的敏感度和準確度區分轉移組與非轉移組患者。在臨床適用性方面，DCA曲線表明當風險度>20%時，模型存在顯著的臨床凈獲益度（圖2C）。CIC曲線則進一步表明，該模型在風險度>20%后預測轉移概率與實際轉移概率具有良好的一致性（圖2D）。

圖1 預測初診鼻咽癌患者遠處轉移的列線圖模型

圖2 預測模型的多維度驗證

2.4 風險評估模型對輕度轉移患者識別能力的初步驗證

根據Nomogram得分，將患者分為以下組別：低風險組（轉移發生概率<30%，得分<260分）、中風險組（轉移發生概率30%～50%，得分260～307分）以及高風險組（轉移發生概率>50%，得分>307分）。進一步分析在早期無轉移患者、中、晚期無轉移患者、輕度轉移患者及重度轉移患者群體中，以上3種風險患者所占比例。結果顯示，早期無轉移患者中、高風險比例為0，中、晚期無轉移患者分別為7.7%、4.9%，而轉移組中高風險構成顯著高于無轉移組。尤為重要的是，輕度轉移患者和中、晚期無轉移患者比較，在全身腫瘤負荷相當的情況下，中、高風險分別占到總體的50.0%和30.8%，證明模型可以有效地輔助鑒別隱匿性的轉移患者（表4）。

表4 各分期患者的轉移風險分布情況分析 n（%）

3 討論

鼻咽癌遠處轉移的精確預測能有效地輔助臨床決策，創造早期干預空間，提高患者生存率和生存質量。N分期[8]和EB病毒拷貝數[9]是目前臨床較為確切的預測指標。但后者由于不同臨床中心EBV-DNA定量檢測標準不同，且鼻咽癌非高發地區陽性檢出率較低等[10]客觀原因存在一定應用局限性。綜合臨床特征、免疫、代謝以及分子病理等因素的綜合評估體系可能較單一因素更為準確可靠。本研究回顧性分析大樣本鼻咽癌患者數據，嘗試將外周血免疫學特征納入多因素預測模型，最終篩選出以下與遠處轉移相關的免疫及臨床獨立高風險因素：N3期、CD4/CD8比值<1.75、NK細胞數目≥257.5個/μL、LDH≥185.5 U/L以及PNI<52.74。據此建立的預測模型能較好地預測初診遠處轉移患者，尤為重要的是，對早期以及隱匿性轉移識別體現了較高的敏感度和特異度，具有較大的臨床應用價值。

隨著近年來腫瘤免疫相關研究的深入，越來越多的證據表明腫瘤患者宿主免疫細胞亞群變化特征與腫瘤的發生發展以及預后呈顯著相關。如Thommen等[11-12]研究發現持續慢性病毒感染和腫瘤患者體內效應T細胞逐漸耗竭和失能，或是感染未控及腫瘤進展的重要因素之一。Nicholson等[13]研究也表明，細胞因子蛋白質抑制劑（SOCS）負性調控IL-15，從而抑制了NK細胞的發育和激活，最終導致腫瘤細胞免疫逃逸的發生。此外，有研究表明治療后發生轉移的鼻咽癌患者與未轉移患者相比，外周血CD8+T淋巴細胞出現顯著下降，且T細胞受體β鏈（TCRB）的多樣性顯著降低[14]。然而，目前關于初診遠處轉移患者宿主免疫背景的研究仍較為缺乏。本研究創新性地納入外周血免疫細胞亞群數量及比例，通過更為精確的單平臺流式細胞術對淋巴細胞亞群數目及比例進行聯合檢測[15]，有助于從免疫學角度進一步厘清初診遠處轉移發生的部分機制。

本研究的局限性主要在于病例篩選可能存在偏倚。由于為回顧性研究，患者在治療前是否接受外周血免疫細胞亞群檢測取決于接診醫生，同時轉移與非轉移患者之間樣本數量相差較大，兩者均可能導致抽樣誤差，影響結果的客觀性。此外，所有病例均來自單中心、非高發區，缺乏有廣泛意義的外部驗證隊列；模型評估為高風險，但尚未遠處轉移證據的患者需要持續觀察，對其預測能力可能具有更重要的臨床意義。

綜上所述，本研究揭示了初診遠處轉移鼻咽癌患者的宿主免疫背景的特征性變化，并利用外周血免疫學相關指標，結合其他臨床因素，建立了初診鼻咽癌患者遠處轉移風險的預測模型。模型在臨床分期、影像學等輔助檢查之外，提供另一種識別早期轉移的工具。研究納入的預后指標除流式檢查以外均為臨床常規檢查項目，而流式細胞術檢測外周血免疫細胞亞群已在國內醫院廣泛開展，模型的經濟性和臨床可及性均有利于推廣。該模型的運用和進一步完善可能有助于各中心提高早期或隱匿性轉移患者的檢出率，對提高此部分患者的生存率有重要意義。