垂體促甲狀腺激素腺瘤中SSTR表達譜及全數字切片自動圖像分析的探索性研究

崔杰 李曉歐 幸兵 張明 肖雨 王文澤

垂體腺瘤是一組顯示較高分化的神經內分泌腫瘤，約占顱內腫瘤的15%。而垂體促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）腺瘤是一種罕見的功能性垂體腺瘤，發病率不足0.01%oo/年，在垂體腺瘤中占比<2%，是導致繼發性甲狀腺功能亢進癥的主要原因[1]。臨床特征主要是血清游離甲狀腺激素水平升高、血清TSH水平不被抑制并伴有不同程度甲亢和甲狀腺腫表現，也可因腫瘤占位效應而出現視野缺損和頭痛等癥狀。多數垂體TSH腺瘤為良性，但可表現局部侵襲，術中見腫瘤多質地韌，手術切除標本肉眼觀察為纖維性質地的較韌腫物。手術是首選治療方式。近年來隨著對該病認識的提高以及激素檢測和影像技術的普及，垂體TSH腺瘤的診斷率明顯提升[2]。

垂體TSH腺瘤的分子機制尚未明確。生長抑素可以抑制多種器官中內分泌和外分泌細胞的分泌和增殖活性，其靶標分子是跨細胞膜的特異性生長抑素受體（somatostatin receptor，SSTR）。SSTR包括5個不同亞型（SSTR1～SSTR5），在不同神經內分泌腫瘤中有不同程度的表達。多項研究表明SSTR的表達與神經內分泌腫瘤的藥物治療反應相關。TSH腺瘤表達SSTR，是術前準備以及術后未緩解患者進行藥物治療的分子基礎。目前在不同亞型的垂體腺瘤中關于SSTR表達譜的研究成為一大熱點和焦點[3-5]。但由于該病罕見，關于TSH腺瘤中各型SSTR表達的研究較少[6-7]，特別是關于各型SSTR在組織中的原位定位研究更為缺乏。

免疫組織化學是一種原位顯示組織中特定蛋白表達水平的半定量研究，具有分辨目標蛋白定位（細胞膜、細胞質及細胞核）的優勢。近年隨著數字病理和圖像智能化分析等技術的發展，基于數字化圖像的全切片圖像分析技術蓬勃發展，特別是在Her2等定位于細胞膜的抗體和Ki-67等定位于細胞核的抗體的免疫組織化學圖像分析方面獲得顯著進展，成為應用在輔助診斷和科研方面的新工具[8-9]。

本研究在垂體TSH腺瘤病例組中利用免疫組織化學方法研究各型SSTR的表達情況，應用全數字切片自動圖像分析技術與常規人工判讀進行對比研究，為后續利用全數字切片自動分析技術對病例進行輔助診斷奠定理論及實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2013年1月至2019年12月北京協和醫院手術治療且經病理確診的垂體TSH腺瘤石蠟包埋組織樣本及相應臨床病理資料。入組標準：1）臨床資料完整，符合TSH腺瘤的臨床表現及實驗室檢查指標；2）術前未行放療等輔助治療；3）由3位有經驗的病理醫師確認，參照2017版世界衛生組織（WHO）內分泌腫瘤分類標準，結合形態學、免疫組織化學及臨床病史等綜合評估符合TSH垂體腺瘤；4）有足夠的存檔組織用于免疫組織化學檢測。最終入組37例患者。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 組織標本均經常規中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋后進行4 μm厚切片。一抗分別采用SSTR1（購自德國Antibodies-online，小鼠單抗，ABIN2476549）、SSTR2 （購自英國ABCAM公司，兔單抗，ab134152)、SSTR4（購自德國Antibodies-online公司，小鼠單抗，ABIN2476551)和SSTR5（購自英國ABCAM公司，兔單抗，ab109495)。抗原修復方法方面SSTR1、SSTR4和SSTR5均采用酶消化法，SSTR2采用高壓熱修復法。抗體滴度SSTR1和SSTR2采 用1∶100稀 釋，SSTR4和SSTR5采用1∶200稀釋，常溫濕盒孵育2 h后選用相應二抗孵育1 h。最后利用DAB顯色，蘇木素復染。各步驟間均嚴格采用PBS沖洗。過程中設置相應的陰性和陽性對照。

SSTR3較為特殊，先后分別采用了4種不同抗體，分別為Antibodies-online公司的小鼠單抗（ABIN247 6550）和ABCAM公司的3種兔多克隆抗體（ab28680、ab227601和ab198851)，在6例不同垂體腺瘤及3例胰腺組織中試驗了不同抗原修復方法（酶消化、微波及高壓熱修復）、不同的抗體滴度（1∶50至1∶500）以及不同的孵育時間（1～48 h）的不同組合。

1.2.2 人工判讀評分及全數字切片自動化圖像分析 各型SSTR染色均以細胞膜顯示棕褐色標記為陽性，參照文獻標準[7]，按照著色強度和比例不同區分為陰性（無著色或<10%細胞膜著色，0分）、弱（≥10%細胞膜的弱而不完整著色，1分）、中（≥10%細胞膜的中等或局部細胞膜完整著色，2分）和強（≥10%細胞膜的強而完整著色，3分），見圖1。全部病例由3位有資質的病理醫師共同評估形成一致意見。

全部免疫組織化學染色切片由NanoZoomer S360數字切片掃描設備（C13220-01，購自日本濱松公司）按照明場、×40、單層、自動對焦掃描成數字化切片，分別導入 Aperio ImageScope 12.3.2.801 3圖像分析軟件，參照軟件說明及相關文獻，自動識別待分析組織切片區域，利用膜抗體Her2 評分參數、輔以人工微調校準（按照圖1中各個評分圖定標）后進行全數字切片自動化圖像分析，評分結果自動輸出。

圖1 SSTR2免疫組織化學0～3分染色圖像

1.3 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。采用x2檢驗，比較各型SSTR不同評分分值占比的差異，以P<0.05為差異具有統計學意義。采用Spearman 等級相關分析，分析不同SSTR亞型之間的相關性，以及各型SSTR表達與性別、年齡、腫瘤大小、Ki-67指數以及侵襲的相關性。人工判讀與軟件圖像自動分析的一致性評價采用組內相關系數（intraclass correlation coefficient，ICC）評價，ICC>0.6為一致性好。

2 結果

2.1 臨床病理特征

入組37例患者，其中男性19例，女性18例；平均年齡43.3歲，中位年齡45歲。腫瘤平均最大徑1.6（0.8～4.9）cm。Ki-67指數1%為83.8%（31/37），Ki-67指數2%為5例，Ki-67指數5%為1例。全部病例中有8例（21.6%）發現局部侵襲。

2.2 各型SSTR表達分析

SSTR3采用了4種不同抗體、在6例不同垂體腺瘤及3例胰腺組織中嘗試了多種試驗條件組合，均未能成功顯色，所以未進行結果分析，但在文中后續部分進行討論。

除SSTR3之外，另外4型SSTR均出現較高程度的細胞膜定位表達（表1，圖1），兩種評價方法均顯示評分多為2分和3分，其中3分占比均超過50.0%（人工評分中3分占比最高，SSTR1、SSTR2、SSTR4和SSTR5的占比分別為59.5%、78.4%、64.9%和56.8%）。兩種評價方法中占比最低的均是0分組（部分0分病例局部有非特異性的細胞質著色），其中全切片自動圖像分析法在各型中0分組占比均為0（圖2）。人工評價相比圖像自動分析顯示在評分兩端（0分組和3分組）占比更高。無論何種評分方法，不同亞型之間是否高表達無顯著性差異（P<0.05）。

圖2 人工判讀和自動圖像分析的SSTR1、SSTR2、SSTR4和SSTR5結果

表1 37例TSH腺瘤各型SSTR評分匯總對比

采用Spearman法分析不同SSTR亞型之間的相關性表明，無論人工判讀還是軟件圖像自動分析評分，SSTR1和SSTR2之間呈顯著相關性（人工r=0.420，P=0.010；軟件r=0.338，P=0.040），其余相互之間無明顯相關性。

2.3 各型SSTR表達與性別、年齡、腫瘤大小、Ki-67指數以及侵襲的相關性

Spearman 相關分析結果表明，兩種評分方法中僅SSTR1表達與侵襲呈負相關（人工r=-0.417，P=0.010；軟件r=-0.406，P=0.013），而各型SSTR的表達與性別、年齡、腫瘤大小以及Ki-67指數均無明顯相關性。

2.4 人工判讀與自動化圖像分析的一致性評價

除SSTR3之外，各型SSTR人工判讀與圖像自動分析的一致性采用ICC法評價，假定不存在交互效應的情況下，ICC值分別為0.891（SSTR1）、0.843（SSTR2）、0.835（SSTR4）和0.925（SSTR5），顯示均具有較好的一致性，其中SSTR5一致性最好。各型SSTR評分結果匯總及統計對比見表1。

3 討論

近年關于垂體腺瘤中SSTR表達譜的研究成為一大熱點，多數是基于RT-PCR和蛋白免疫印跡的方法[3，5，10-11]，采用免疫組織化學方法在垂體腺瘤組織中原位顯示各型SSTR表達情況的研究較少，TSH腺瘤較罕見，關于TSH腺瘤中SSTR表達的研究更加缺乏，僅有為數不多的小規模病例研究[6-7，12]，已發表的國內外文獻中規模最大的研究僅納入16例病例。本研究成功納入37例病例，是數量較多的關于TSH腺瘤的研究。

本研究結果證實SSTR1、SSTR2、SSTR4和SSTR5在TSH腺瘤細胞膜上均有較高程度的表達，兩種評分方法中3分占比均超過50.0%（人工評分中3分占比最高，SSTR1、SSTR2、SSTR4和SSTR5的占比分別為59.5%、78.4%、64.9%和56.8%）。當然，在垂體腺瘤中并非簡單的“SSTR表達越高，使用相關藥物效果越好”。其中涉及SSTR的復雜的病理生理作用機制，尚需深入詳盡的轉化醫學研究[3]。相關性分析表明僅SSTR1的表達與TSH腺瘤的侵襲呈負相關（人工r=-0.417，P=0.010；軟件r=-0.406，P=0.013），各型SSTR的表達與性別、年齡、腫瘤大小以及Ki-67指數均無明顯相關性。本研究結果與之前關于其他類型垂體腺瘤的多數研究以及僅有的數篇關于TSH腺瘤的報道基本相符[1，5-7，12]，提示以上4型SSTR，特別是SSTR1，可能在TSH腺瘤的發生、侵襲以及藥物治療反應中可能起重要作用。本研究中這幾個SSTR亞型均選用新近商品化的單克隆抗體，具有相對更高的特異性。

本研究結果與之前文獻報道最大的差異在于未能發現SSTR3的陽性表達，盡管本課題組先后使用了4種不同SSTR3抗體、在6例不同垂體腺瘤中嘗試了多種實驗條件組合，其原因可能是多方面的：1）有報道功能性垂體腺瘤中主要表達SSTR2和SSTR5，而SSTR3主要在垂體無功能腺瘤中表達[13]。因而可能在功能性腺瘤中SSTR3表達水平較低、低于免疫組織化學方法的檢測下限。功能性垂體腺瘤也各有特點[14]，可能TSH腺瘤具有相對獨特的SSTR表達譜。2）之前關于TSH腺瘤中SSTR3表達的研究中，Herguido等[10]的研究證實TSH腺瘤中SSTR3 mRNA表達低，雖然該研究中描述使用免疫組織化學的方法證實6例TSH腺瘤中均有SSTR3表達，但其使用的抗體（ab137026[Abcam]）說明書中明確表示僅適用于流式和免疫印跡法，并不適用于其所采用的的石蠟包埋組織。Korner等[15]的對比研究也證實，目前商品化的SSTR3抗體尚未具備足夠特異性。垂體腺瘤中SSTR3的表達有待于更深入嚴謹的研究，特別是多層面（mRNA和蛋白）、多種方法（PCR、WB以及IHC）的系統化確證。

基于數字化全切片的圖像自動分析技術是近來依賴于最新的人工智能自動化圖像分析方法發展的新技術[8-9]。本研究將其首次應用于垂體腺瘤研究，結果顯示，經過微調參數后，全數字切片自動化圖像分析技術在TSH腺瘤的SSTR免疫組織化學表達評估中取得了與病理醫師相當的評估效果，各型SSTR的ICC值分別為0.891（SSTR1）、0.843（SSTR2）、0.835（SSTR4）和0.925（SSTR5），顯示均與人工評分具有較好的一致性。該技術的應用可提供重復性更好的免疫組織化學評估方法，有助于減少病理醫師簡單重復的圖像評估工作[8-9]。

本研究尚有局限性：1）使用的是存檔石蠟包埋組織樣本，相對于新鮮組織具有不可逆的、伴隨組織處理過程的繼發改變。2）能夠應用于石蠟包埋組織的穩定技術相對較少，檢測其中mRNA的方法目前均要求短期固定標本，對于多年存檔標本的檢測效果均較差[16]，導致本研究中僅采用了免疫組織化學的方法。3）圖像自動分析技術仍在飛速發展，目前仍有一定局限性[8-9]，如對非特異著色（細胞膜以外的著色）識別稍差，可能是其評分中無0分的原因；另外其對強染色時相鄰不同細胞的細胞膜的區分度有待提高，這可能也是其高分（3分）組占比較低的潛在原因。上述問題的解決亟需圖像分析算法方面有針對性的加強。

綜上所述，本研究證實垂體TSH腺瘤腫瘤組織中SSTR1、SSTR2、SSTR4和SSTR5均有較高水平表達，利用基于數字化全切片的圖像自動分析技術可獲得與病理醫師人工判讀相當的評估效果。SSTR表達譜研究結果能否應用于臨床涉及很多因素，包括表達的SSTR是否有缺陷、相應的分子背景以及細胞骨架蛋白和分子通路是否受到影響等，尚需要深入全面的系統研究[17]，特別是詳盡的表達譜研究結合細化的組織病理分型、藥物反應和長期療效的對比研究。