地佐辛聯合異丙酚麻醉對大鼠海馬組織p38MAPK信號通路及認知功能的影響

張雅磊，李 偉，李光耀

(空軍軍醫大學唐都醫院麻醉手術科，陜西 西安710038)

丙泊酚是臨床最常用的靜脈麻醉藥之一，被廣泛用于內窺鏡檢查、妊娠中斷、陰道取卵等各種無痛手術，有研究[1]指出，在哺乳動物的發育過程中，丙泊酚會引起大腦神經細胞的毒性，對幼年及成年空間學習記憶造成影響。丙泊酚在哺乳動物大腦發育階段會產生神經毒性，造成神經元的凋亡，使樹突棘密度降低，并帶來長期的認知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)[2]。地佐辛是具有強力鎮痛作用、不良反應較少、對循環和呼吸抑制較輕的新型的阿片類藥物，精神依賴性也較低，因此，其在臨床麻醉鎮痛和術后鎮痛領域應用十分廣泛[3]。p38MAPK是MAPK家族的重要成員，主要以炎癥、壓力、傷害等信號傳遞為媒介，促炎細胞因子、毒素等會促進其表達，在神經退行性改變中扮演重要角色，異常活性化的p38MAPK通路引起細胞增殖停滯和凋亡[4-5]。近年來，研究發現p38MAPK信號通路在神經細胞凋亡過程中扮演重要角色，神經細胞的凋亡和增殖以及細胞組織的損傷程度的都能通過p38MAPK來體現[6]。隨著研究的深入，發現p38MAPK信號通路與疼痛中的疼痛信息傳達和調節有關，丙泊酚誘導的大鼠神經細胞凋亡過程中，MAPK路徑的活性可受到不同各種程度的影響，使磷酸化p38表達上升[7]。由此，本文采用地佐辛聯合丙泊酚麻醉，探討地佐辛聯合異丙酚麻醉對大鼠海馬組織p38MAPK信號通路及認知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 模型建立和分組 16～17周齡的SD大鼠30只，體重(226±10.26)g，分為ZC組(正常大鼠)，YM組(異丙酚100 mg/kg麻醉大鼠)，DX組(地佐辛3 mg/kg+異丙酚100 mg/kg麻醉大鼠)。YM組大鼠首次給予異丙酚50 mg/kg腹腔注射，待大鼠翻正后再追加50 mg/kg，DX組異丙酚麻醉同YM組后給予地佐辛腹腔注射3 mg/kg。

1.2 實驗方法

1.2.1 認知功能觀察。①水迷宮實驗觀察三組大鼠平均潛伏期：實驗動物清醒后3 h，根據文獻[8]方案進行水迷宮實驗，實驗前將大鼠放入迷宮中游60 s，并自4個象限將大鼠隨機放入水中，面對水池壁，觀察大鼠游至平臺登臺所需時間，登臺后將大鼠控制在平臺上20 s，有未找到平臺的大鼠，則需促使其爬至平臺停留20 s，潛伏期記60 s，實驗8次，記后4次，計算平均潛伏期。②空間探索實驗觀察三組大鼠空間探索能力：將水迷宮平臺撤除，把大鼠從第3象限處放入水迷宮中，自游60 s，觀察并記錄原平臺象限大鼠所逗留的時間。

1.2.2 海馬區組織結構觀察：實驗結束后，腹腔注射麻醉斷頭處死大鼠，將取出的雙側海馬組織利用甲醛溶液固定，乙醇溶液脫水，石蠟包埋后切片4 μm，封閉處理應用山羊血清進行，HE染色復染分別為6～8 min和10 s，于顯微鏡下觀察三組大鼠海馬區組織結構改變情況。

1.2.3 海馬組織 p38MAPK表達水平檢測：取海馬組織加入裂解液，制備組織勻漿采用RT-PCR法檢測p38MAPK表達水平，總RNA運用Rizol法進行提取，總RNA提取反轉錄成 cDNA，按說明書進行實驗，用DNA熒光染料SYBR GreenⅠ對p38MAPK表達水平進行檢測，內參采用β-actin，60 ℃、10 min，95 ℃、72 ℃各 30 s，95 ℃、5 min，循環次數以40為準，實驗次數至少3次，用相對定量2-△△CT計算p38MAPK水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 海馬組織p38MAPK蛋白表達水平檢測：取石蠟包埋的海馬組織采用Western blot法測定p38MAPK蛋白變化，用PBS溶液來洗滌，切碎再加1 ml的裂解液，測定組織勻漿中蛋白濃度，SDS-PAGE 100 V電泳，Bradford法來定量電泳產物，再移至PVDF膜，10%山羊血清封閉0.5 h，一抗過夜4 ℃下孵育，二抗室溫下孵育60 min，室溫下可洗膜，洗3次，GAPDH作內參，用Quantity one 4.0軟件分析p38MAPK蛋白表達。

2 結 果

2.1 三組大鼠平均潛伏期比較 水迷宮實驗發現，訓練次數增多，大鼠的平均潛伏期出現顯著降低；選擇大鼠后4次逃避潛伏期進行計算，發現與ZC組對比，YM組大鼠平均潛伏期明顯增長，DX組平均潛伏期低于YM組，高于ZC組(均P<0.05)。見圖1。

注：與ZC組比較，*P<0.05；與YM組比較，#P<0.05

2.2 三組大鼠空間探索能力比較 與ZC組大鼠對比，YM組大鼠在平臺象限停滯時長變短，空間探索能力呈減弱趨勢；DX組平臺象限停留時間較YM組有所增加，但低于ZC組，空間探索能力較YM組有所增強(均P<0.05)。見圖2。

注：與ZC組比較，*P<0.05；與YM組比較，#P<0.05

2.3 三組大鼠海馬區組織結構比較 ZC組海馬區組織神經細胞排列緊密，細胞核完整；YM組海馬區組織神經細胞出現凋亡，排列紊亂且疏松，細胞核偏移；DX組海馬區組織神經細胞少量凋亡，細胞排列較稀疏，細胞核偏移較少。見圖3。

圖3 三組大鼠海馬區組織結構(HE染色，×200)

2.4 三組大鼠海馬區組織p38MAPK表達水平比較 與ZC組對比，YM組p38MAPK水平明顯增高，與YM組比對，DX組p38MAPK水平表達低于YM組，但高于ZC組(均P<0.05)，見圖4。

注：與ZC組比較，*P<0.05；與YM組比較，#P<0.05

2.5 三組大鼠海馬區組織p38MAPK蛋白表達水平比較 與ZC組對比，YM組p38MAPK蛋白表達顯著增強，與YM組比對，DX組p38MAPK蛋白表達低于YM組，但高于ZC組(均P<0.05)，見圖5。

注：與ZC組比較，*P<0.05；與YM組比較，#P<0.05

3 討 論

丙泊酚的作用機制主要通過興奮突觸前膜和突觸后膜受體，起到抑制中樞的作用，麻醉蘇醒延遲對認知和記憶功能會產生一定損傷[9]。認知功能障礙是手術、麻醉等多因素引起的中樞神經系統并發癥。認知功能障礙的發生是由各種各樣的因素引起的神經退行的變化，病態生理學的過程與神經內分泌等多個系統有關，而異丙酚麻醉可引起認知功能障礙[10]。地佐辛是常用的臨床鎮痛劑，起效迅速，可長時間維持，在發揮抑制疼痛反應的同時，還可改善麻醉后所引起的認知功能障礙，在臨床廣泛地被使用[11]。

我們通過觀察大鼠平均潛伏期和空間探索能力發現，水迷宮實驗發現，訓練次數增多，各組大鼠平均潛伏均有所降低，取各組大鼠后4次逃避潛伏期，進行計算發現與ZC組相比，YM組大鼠平均潛伏期明顯增長，DX組平均潛伏期低于YM組，高于ZC組。與ZC組大鼠對比，YM組大鼠在平臺象限停留時間縮短，空間探索能力變弱，DX組平臺象限停留時間較YM組有所增加，但低于ZC組，空間探索能力較YM組有所增強。有研究證實，靜脈麻醉藥物和吸入麻醉可與腦內許多相關受體結合，這些受體可能與認知功能有關，因此麻醉對腦神經產生阻礙或興奮作用，極易引起認知功能障礙[12]。丙泊酚可阻礙海馬突觸的長期增強，對突觸可塑性產生作用，從而影響人體的學習功能及記憶功能[13]。研究報道地佐辛對七氟醚麻醉大鼠出現的認知功能障礙有改善作用，這可能與相關通路和海馬中的蛋白表達有關[14]，這與本文研究結果相符。

p38MAPK屬于MAPK家族成員之一，在神經細胞增殖、分化和凋亡過程中具有非常重要的作用。近年有研究報道p38MAPK在學習記憶能力降低的過程中具有重要的作用。有研究表明p38MAPK抑制劑的使用可降低新生大鼠學習和記憶能力的損害。我們通過觀察HE染色，p38MAPK水平和蛋白變化發現，ZC組海馬組織神經細胞排列緊密，細胞核完整。YM組海馬組織神經細胞大量凋亡，排列紊亂且疏松，細胞核偏移。DX組海馬組織神經細胞少量凋亡，細胞排列較稀疏，細胞核偏移較少。與ZC組對比，YM組p38MAPK水平明顯增強，與YM組比對，DX組p38MAPK表達水平低于YM組，但高于ZC組。與ZC組對比，YM組p38MAPK蛋白表達顯著增強，與YM組比對，DX組p38MAPK蛋白表達低于YM組，但高于ZC組。有研究證實，神經系統對內外環境的影響非常敏感，由內外因素引起的神經元活性變化，能引起神經元形態和功能的突變，對神經系統的正常發育產生影響[15]。有研究顯示，p38MAPK信號傳輸路徑不僅在學習和記憶的調節中起重要作用，而且對神經細胞的發育及相關結構的增殖、增長、分化及功能維持中也起重要作用[16]。p38MAPK可降低學習和記憶能力，阻礙p38MAPK路徑的活性，可減輕認知功能障礙，而p38MAPK是中樞神經系統的重要信息傳遞系統，海馬的p38MAPK的表達增加和學習、記憶功能降低有關系[17-18]。有研究證實，地佐辛的非麻醉效果研究發現，在腦損傷時，激活的p38MAPK信號通路可受到抑制，關聯蛋白也可受到調控，炎性反應得到改善，發揮神經保護作用[19-20]。

綜上所述，異丙酚麻醉可激活p38MAPK活性，引起認知功能障礙，地佐辛聯合異丙酚可抑制p38MAPK活性，對認知功能影響較小。本研究分別應用異丙酚單獨麻醉和地佐辛與異丙酚聯合麻醉大鼠，探究大鼠認知功能的變化及其可能的影響機制。為臨床上推廣地佐辛與異丙酚聯合麻醉奠定了理論基礎。然而更深入的影響機制需要進一步的體內和體外實驗驗證。且需要進行大量的臨床試驗以達到進一步的臨床推廣。