口腔鱗癌組織長鏈非編碼RNA LINC01605表達與臨床病理特征關系研究

施 健，胡千慧 ，張雪杰

(1.錦州醫科大學附屬第二醫院，遼寧 錦州121000；2.錦州醫科大學附屬第一醫院神經內科，遼寧 錦州121012)

口腔鱗癌是頭頸部最常見的腫瘤之一，起源于鱗狀上皮的惡性轉變。鱗癌細胞具有高增殖性，病變具有侵襲性、進展性的特征[1-2]，其發病原因尚不清楚。近年隨著分子生物學的發展，學者重點關注基因調控通路異常在腫瘤形成和進展中的作用，并認為多種因子參與腫瘤的進展，也是腫瘤形成的重要因素之一[3]。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是指超過200 bp的單核苷酸序列的統稱，近年學者關注到其與腫瘤的形成和進展相關，由于其種類眾多，因此現階段對LncRNA的研究較為局限。LncRNA雖然不具有編碼蛋白的功能，但是其可作為多種具有調控因子的下游因子發揮作用，其下游因子包括微小RNA(microRNA,miRNA)及相關靶蛋白等[4]。本研究探討LncRNA LINC01605(LINC01605)在口腔鱗癌中的表達特征，分析其與增殖相關指標的關系，探討其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2017年1月至2018年4月在我院確診為口腔鱗狀細胞癌的患者作為研究對象。病例納入標準：①均行手術根治性治療，術后經病理檢查確診，符合WHO的病理診斷標準；②臨床隨訪資料完整。排除標準：①術前行放、化療者；②伴有較嚴重的基礎性疾病者；③病理形態中具有異源性分化者。共選擇58例，其中男30例，女28例，年齡38～83歲，中位年齡59歲，其中高分化21例，中分化27例，低分化10例。留取腫瘤組織和距腫物邊緣>3 cm的正常口腔黏膜組織為對照，標本均于術后30 min內完成取材，并立即置于-80℃冰箱中凍存。本研究經醫院倫理委員會批準通過，符合《赫爾辛基宣言》中的要求。

1.2 研究方法

1.2.1 實時熒光定量PCR：基于術后新鮮凍存組織進行檢測，應用實時熒光定量PCR(quantitative PCR)法檢測LINC01605的表達。應用Trizol(美國Invitrogen公司)提取總RNA，鑒定純度。反轉錄法(廣州復能基因有限公司)獲得cDNA。引物由廣州復能基因有限公司合成，LINC01605引物上游：5’-GCTAACACTGGAAGAGAGATCGCT-3’，下游：5’-CTGTGAGTGGGCCGGTGCCAAAC-3’。選擇U6作為內參，上游：5’-CTCGTTTACGCAACGTATACACA-3’，下游：5’-AACGGCAGCCGAGGTACGTGT-3’。執行實時PCR(PCR儀為美國伯樂公司生產)，程序設定：95 ℃預變性30 s；變性95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 30 s，共30個循環。結果以2-ΔΔCT表示。

1.2.2 免疫組化實驗：應用免疫組化二步法檢測腫瘤組織中Ki67的表達，Ki67工作液購自北京中杉金橋生物技術公司。腫瘤組織經中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋后，切取4 μm切片后應用免疫組化二步法進行檢測，DAB顯色。操作嚴格按實驗步驟完成，設陽性對照(扁桃體組織)，做好質控工作。Ki67的表達部位為細胞核，以棕黃色為陽性，選擇3個高倍視野(400倍)計算百分率，取平均值計為增殖指數。

2 結 果

2.1 LINC01605在口腔鱗癌和正常口腔黏膜組織中的表達量比較 LINC01605在口腔鱗癌中的表達量(1.32±0.25)明顯高于正常口腔黏膜組織(1.02±0.30)(t=4.31，P=0.010)。

2.2 LINC01605在口腔鱗癌不同臨床病理特征分組中的表達比較 LINC01605的表達在不同腫瘤最大徑、分化程度及有無脈管癌栓的分組中表達比較差異有統計學意義(均P<0.05)。而在不同性別、年齡、有無吸煙史及有無神經累犯的分組中差異無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 LINC01605在口腔鱗癌不同臨床病理特征分組中的表達比較

2.3 口腔鱗癌組織中LINC01605與Ki67的相關性分析 免疫組化檢測到口腔鱗癌中Ki67增殖指數的范圍是10%～70%，平均32.58%。應用Pearson相關分析顯示LINC01605與Ki67增殖指數具有正相關性(r=0.64，P=0.029)。見圖1。

圖1 口腔鱗癌組織中LINC01605表達與Ki67的相關性

2.4 口腔鱗癌組織中LINC01605表達與患者生存時間的關系 對患者進行術后3年(36個月)生存時間的隨訪，隨訪到患者術后的生存時間為10～36個月，中位生存期26個月，其中失訪2例(計為刪失值)。應用K-M生存分析顯示LINC01605的表達與術后生存時間相關(臨界值1.32，χ2=4.24，P=0.040)。即LINC01605高表達患者生存時間較短。見圖2。

圖2 口腔鱗癌組織中LINC01605表達與患者生存時間的關系

3 討 論

LncRNA是近年研究的熱點。研究顯示LncRNA由對應的基因轉錄形成，具有5’帽子和ploy尾巴，通過剪切形成的成熟體，參與表觀遺傳學調控、細胞周期調節和細胞分化調控[5-6]。雖然近些年發現在ceRNA機制中LncRNA通過競爭性結合miRNA調控其對應的靶基因，但是相關實驗仍然發現LncRNA在腫瘤中可能具有獨立地調控生物學功能的作用，尤其是其表達異常時可能預示著某些生物學功能[7-8]。LINC01605是我們在進行生物信息分析時發現的與腫瘤相關的因子，應用qRT-PCR檢測后發現LINC01605在口腔鱗癌中表達升高，證實了Gepia中的分析結果，提示LINC01605具有癌基因樣的作用，對腫瘤形成有重要的促進作用。本研究結果顯示LINC01605在口腔鱗癌不同腫瘤最大徑的表達差異有統計學意義，提示LINC01605高表達時腫瘤可能處于快速生長狀態，LINC01605與Ki67的相關性，亦證實了LINC01605高表達對腫瘤生長具有的促進作用，但是關于LINC01605是否具有直接調控腫瘤增殖的作用，尚有待基礎研究中的細胞學實驗，并應用CCK-8等實驗進行明確。LINC01605促進腫瘤生長可能是其經典作用，其下游的多種調控因子也具有增殖促進作用。Wang等[9]研究發現LINC01605通過調控miR-493-3p促進鱗癌的增殖、抑制凋亡；Qin等[10]通過高通量測序鑒定LncRNA在腫瘤中的表達差異，發現LINC01605在膀胱癌組織中表達上調。通過PCR法檢測膀胱癌和正常尿路上皮組織以及人類膀胱癌細胞系中LINC01605的相對表達水平，并通過CCK-8實驗、集落形成實驗、Transwell實驗和異種移植瘤小鼠模型等，發現LINC01605在膀胱癌細胞和組織中均高表達，且與組織學分級和臨床分期有關，并通過生存分析證實LINC01605高表達的患者預后差，并發現LINC01605可激活上皮間質轉化(EMT)，促進基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloprotein,MMP-9)的表達，認為LINC01605可以通過激活EMT信號通路和上調MMP-9表達，促進膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲。此研究的部分結論與本研究在口腔鱗癌的結論相仿。本研究結果還顯示LINC01605的表達與腫瘤的分化程度相關，提示LINC01605對腫瘤由幼稚到成熟的分化過程可能有調控作用，即LINC01605對腫瘤分化可能有抑制作用[11]。低分化的腫瘤細胞常伴有更原始的形態、細胞有多向分化及旺盛的生長能力，LINC01605在趨于原始的腫瘤細胞中具有高表達，或者說具有標記作用，提示LINC01605可能具有干細胞的標記作用或促進干細胞分化的相關功能[12]，但這需要后續更多實驗來證實。本研究結果還顯示LINC01605的表達與腫瘤的脈管癌栓相關，提示LINC01605高表達可能對促進腫瘤細胞的脈管侵犯或腫瘤細胞的遷移有關，也提示LINC01605高表達預示著腫瘤具有較強的侵襲性[13]。LINC01605的作用方式復雜，其在腫瘤中的相關調控功能多，雖然多種靶因子如miR-145[14]和EZH2等[15]是已被證實的調節軸，但是由于其下游因子眾多[16-17]，其生物學調節通路可能具有交叉性及協同性。Yue等[18]從GSE97300、GSE84983、GSE110715、GSE70880和GSE75970微陣列中篩選差異表達的LncRNA，分析LINC01605的表達與登記的結直腺癌患者的臨床表型之間的相關性，發現LINC01605在腫瘤中高表達，不僅證實了其高表達患者預后差，還發現了LINC01605受SMYD2-EP300介導的組蛋白H3K4me3和H3K27ac修飾的調節，并發現LINC01605與METTL3結合能促進SPTBN2 mRNA的m6A修飾，促進SPTBN2的翻譯，認為這是結腸癌發生的機制之一。Garcia-Etxebarria等[19]發現LINC01605、PROKR2和CCSER1基因可能是結腸腺瘤惡變的風險基因，且LINC01605可以作為預測結腸癌風險模型的重要因子。因此要闡明LINC01605的表達特征與機制有待更多實驗來進一步明確，這不僅對闡明鱗癌的進展有意義[20-21]，還對基于ceRNA理論闡明LINC01605的作用過程有更深入的理解[22-23]。本研究結果證明LINC01605高表達患者的預后差，提示檢測LINC01605的表達對初步判斷口腔鱗癌的預后有一定價值，但是這需要后續研究進行多中心、大樣本等研究后明確，并對其可能的臨界值進行確定。學者在其他的惡性腫瘤中也發現了LINC01605對預后判斷有一定價值[10]，LINC01605在不同腫瘤中對預后判斷的價值也是后續研究的內容。

總之，口腔鱗癌中LINC01605的表達升高，在病變的形成和進展中有重要作用，LINC01605與增殖指標具有相關性，術后檢測LINC01605的表達對判斷預后可能有一定價值。