內毒素通過干預大鼠玻璃體中晶狀體蛋白家族蛋白表達影響視網膜電圖波幅和玻璃體通透性機制研究

薛 濤，張娟娟，杜建英，馬文婷，董永孝

(咸陽市第一人民醫院眼科,陜西 咸陽 712000)

糖尿病視網膜病變是糖尿病常見的微血管并發癥之一，也是50歲以上糖尿病患者主要的致盲原因。隨著經濟的發展、飲食習慣的改變與人口老齡化，該病的患病率也在不斷提高[1]。糖尿病視網膜病變一旦發生不可逆轉，病情變化復雜，需要長期治療，且治療效果有限。糖尿病可造成機體微血管循環障礙，促使基底膜增厚，損傷血管內皮細胞，誘發內皮細胞增生，使毛細血管壁內的周細胞丟失甚至凋亡，導致毛細血管床血液灌注不足，促進形成新生血管，導致眼球發生變化[2-3]。雖然糖尿病可造成視網膜缺血，在血管再通后，部分患者的視功能反而下降[4]。糖尿病視網膜病變的眼球變化主要包括視網膜水腫、新生血管、視網膜靜脈迂曲擴張、點狀出血斑、視網膜前出血等[5]。鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)誘導的糖尿病視網膜病變大鼠是目前比較公認的經典模型，具有成模率高、手術操作簡便等特點。同時判斷糖尿病視網膜病變成模也涉及眼球的檢查,而目前眼球生物學參數的觀察方法較多,包括血管熒光造影、血管消化鋪片、眼底成像等[6-7]。糖尿病視網膜病變的具體發病機制還不明確，不過多伴隨有內毒素的異常表達，特別是內毒素的釋放可導致大量炎癥高峰期蛋白滲出和炎性細胞浸潤，使得視網膜和脈絡膜病情惡化[8]。同時內毒素可也活化機體的自身免疫性T淋巴細胞表達，從而導致機體病情反復與慢性化[9]。本文具體探討了內毒素通過干預大鼠玻璃體中晶狀體蛋白家族蛋白表達影響視網膜電圖波幅和玻璃體通透性的機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠購自陜西省食品藥品檢驗研究院[許可證號SYXK(陜)2018-002，體重180～200 g，4～5周齡]，普通飼料，自由飲水，晝夜節律光照條件，室溫18.0～20.0 ℃，濕度60.0%～70.0%。所有動物實驗均根據《實驗室動物護理和使用指南》進行實驗，也得到了動物管理倫理委員會的批準。STZ購自美國Sigma 公司，內毒素購自美國Sigma公司，抗血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體、抗血管內皮細胞生長因子受體2(Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)抗體購自深圳晶美公司，GT-2000型視覺電生理檢測儀購自重慶醫用設備公司。

1.2 糖尿病視網膜病變大鼠模型的建立 所有大鼠經適應性飼養1周后開始造模,造模前所有大鼠均禁食12 h，一次性腹腔注射2%鏈STZ溶液(劑量10 mg/kg)。造模過程中每日更換墊料,保證充足的飲水和食物。在造模后72 h取大鼠尾靜脈取血測血糖，造模成功標準：連續3次隨機血糖>16.7 mmol/L。

1.3 大鼠分組與處理 將造模成功的大鼠(n=36)隨機平分為三組：模型組、內毒素A組、內毒素B組，每組12只。大鼠腹腔注射適量戊巴比妥鈉使大鼠麻醉，將大鼠眼球放于顯微鏡下，內毒素A組、內毒素B組擴瞳后分別給予玻璃體腔注射30 ng/ml或60 ng/ml內毒素1 μl，模型組注射等體積的0.9%氯化鈉溶液，1次/周，持續4周。

1.4 觀察指標 ①一般狀態：在大鼠處理第1、2、4周觀察大鼠的一般狀況，包括尿量、毛色、皮膚狀態、食量、飲水量等，同時稱量大鼠體重。②在大鼠處理1、2、4周抽取尾靜脈血，采用血糖儀測定血糖值。③在大鼠處理1、2、4周麻醉大鼠，散瞳后以視覺電生理檢測儀分別記錄視網膜電圖a波與b波波幅。④在造模后4周處死所有大鼠，收集視網膜組織樣本，進行視網膜血管消化鋪片過碘酸-Schiff(PAS)染色，計數周細胞、內皮細胞數。⑤造模后4周取眼球組織，經液氮速凍轉至-80 ℃，研磨提取蛋白，采用Western blot法檢測VEGFR2、VEGF蛋白相對表達水平。

2 結 果

2.1 三組大鼠一般狀態對比 內毒素A組、內毒素B組表現出多尿、多飲、多食、大便稀薄、行動逐漸遲緩、毛色枯槁、晶體混濁等癥狀，內毒素A組、內毒素B組處理第1、2、4周體重低于模型組(均P<0.05)，內毒素B組低于內毒素A組(P<0.05),見表1。

表1 三組大鼠處理不同時間點體重對比(g)

2.2 三組大鼠血糖水平對比 內毒素A組、內毒素B組處理第1、2、4周的血糖高于模型組(均P<0.05)，內毒素B組高于內毒素A組(P<0.05)，見表2。

表2 三組大鼠處理不同時間點血糖水平對比(mmol/L)

2.3 三組大鼠視網膜電圖a波、b波波幅對比 內毒素A組、內毒素B組處理第1、2、4周的視網膜電圖a波、b波波幅低于模型組(均P<0.05)，內毒素B組低于內毒素A組(P<0.05)，見表3。

表3 三組大鼠處理不同時間點視網膜電圖a波、b波波幅對比(μV)

2.4 三組大鼠視網膜細胞計數對比 內毒素A組、內毒素B組處理第4周的視網膜周細胞計數低于模型組(均P<0.05)，內皮細胞計數高于模型組(均P<0.05)，內毒素A組與內毒素B組對比差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 三組大鼠處理第4周視網膜細胞計數對比(個/mm2)

2.5 三組大鼠VEGF與VEGFR2表達水平對比 內毒素A組、內毒素B組處理第4周的眼球組織VEGF與VEGFR2相對表達水平高于模型組(均P<0.05)，內毒素B組高于內毒素A組(P<0.05)，見表5。

表5 三組大鼠處理第4周眼球組織VEGF與VEGFR2相對表達水平對比

3 討 論

糖尿病視網膜病變是由糖尿病引起的一種慢性微血管并發癥，其發病率隨著糖尿病病程的延長也不斷地增高[10]。糖尿病病程>5年的患者，視網膜病變的發生率在30%以上；而病程>20年的糖尿病患者中，視網膜病變的發生率在80%以上[11]。糖尿病視網膜病變引起的失明嚴重影響著患者的生活質量，并增加患者的健康負擔。如何在早期阻止或延緩該病的發生，對減少醫療費用與提高患者生活質量具有重要價值。現代研究表明糖尿病視網膜病變的發生主要受遺傳與環境兩方面原因的影響，特別是機體激酶插入區受體基因、醛糖還原酶基因、血管內皮生長因子基因、晚期糖基化終產物受體基因表達的變化是糖尿病視網膜病變病發生的因。同時糖尿病病程、尿微量白蛋白、血糖、糖化血紅蛋白等升高也均可造成糖尿病視網膜病變的進展[12]。本研究顯示內內毒素A組、內毒素B組處理第1、2、4周體重低于模型組，內毒素B組低于內毒素A組；內毒素A組、內毒素B組處理第1、2、4周的血糖高于模型組，內毒素B組高于內毒素A組，表明內毒素可導致糖尿病視網膜病變大鼠體重降低，促使血糖持續升高。從機制上分析，內毒素可使得細胞膜脂質過氧增強，使鈣離子內流增加，引起線粒體功能的障礙，破壞膜的正常結構，從而引起細胞的破壞，導致視網膜受損，使得糖尿病視網膜病情惡化[13]。

糖尿病視網膜病變是以新生血管形成為主要標志的微血管并發癥，特別是判斷成模成功與否也涉及眼球形態的檢查[14]。眼底照相和血管熒光造影是臨床上檢測糖尿病視網膜病的金標準，其在大鼠中可見血管迂曲、無灌注區、滲漏等表現。有研究的病理結果顯示糖尿病視網膜病變大鼠的視網膜變薄，與色素上皮層有部分脫離，間質水腫，毛細血管輕微擴張，血管壁增厚，組織輕微水腫；而正常大鼠視網膜各層結構清晰，毛細血管未見擴張，神經節細胞排列緊密[15]。當前從眼球形態學觀察微血管變化的方法很多，視網膜血管消化鋪片的應用比較多。其能直觀地觀察視網膜微血管分布、形態、走向及內皮細胞增生、周細胞凋亡等情況。本研究顯示內毒素A組、內毒素B組處理第4周的視網膜周細胞計數低于模型組，內皮細胞計數高于模型組，內毒素A組與內毒素B組對比差異有統計學意義。從機制上分析，糖尿病視網膜病變可導致大鼠視網膜開始出現毛細血管基底膜增厚與毛細血管網分布紊亂，從而誘發出現內皮細胞增殖與周細胞減少。內毒素可使得大鼠虹膜毛細血管外浸潤的中性粒細胞和淋巴細胞出現空泡樣變、染色質邊集的凋亡表現，并且其可導致血-視網膜屏障被破壞而致視網膜受損[16]。并且其還可激活自身的血管內皮細胞和白細胞，使中性粒細胞聚集黏附，釋放出多種黏附分子，從而使其在血管內的流速減慢[17]。

糖尿病視網膜病變是糖尿病的一種嚴重的微血管并發癥，它可能引起視網膜脫離、玻璃體出血等，從而導致視力急劇減退。同時70%左右的糖尿病視網膜病變患者可喪失勞動能力，甚至致殘、致死[18]。本研究顯示內毒素A組、內毒素B組處理第1、2、4周的視網膜電圖a波、b波波幅低于模型組，內毒素B組低于內毒素A組，表明內毒素可影響糖尿病視網膜病變大鼠的視網膜電圖波幅。從機制上分析，內毒素可使得機體大量釋放炎癥因子，內毒素不僅活化血淋巴細胞參與炎性反應，同時還誘導血淋巴細胞發生凋亡，可堵塞微血管，通透性增高，引起線粒體功能的障礙，導致視網膜電圖波幅發生改變。

糖尿病視網膜病變可觸發病理性血管新生，可誘導血管相關生長因子釋放到玻璃體腔。VEGF為一種絲裂原，能夠促進血管內皮細胞的生長和分化，從而誘導新生血管的形成。有研究顯示在視網膜靜脈閉塞與糖尿病視網膜病變患者的眼中，VEGF的水平顯著提高，直接導致了血管組織損傷、內皮細胞增生與新生血管的形成[19]。而在長期糖尿病的情況下，炎癥環境與氧化應激可刺激視網膜血管內皮細胞凋亡和毛細血管退化，導致局部缺血，造成疾病惡化。VEGFR2在病理性血管生成的發展中發揮關鍵的作用，可通過介導信號通路來調節視網膜血管內皮細胞的增殖和遷移。本研究顯示內毒素A組、內毒素A組處理第4周的眼球組織VEGF與VEGFR2相對表達水平高于模型組,內毒素B組高于內毒素A組，表明內毒素可影響糖尿病視網膜大鼠的玻璃體中晶狀體蛋白家族蛋白表達情況。從機制上分析，內毒素可刺激視網膜組織淋巴細胞、血管內皮細胞產生單核細胞趨化因子，引起局部微循環障礙，引起中性粒細胞和淋巴細胞的趨化移行，導致微血管通透性增加，引起玻璃體通透性發生損傷[20]。本研究也存在一定的不足，沒有納入空白對照組，也沒有納入其他處理方法，大鼠數量也比較少，將在后續研究中深入探討。

總之，內毒素可上調糖尿病視網膜病變大鼠的玻璃體中晶狀體蛋白家族蛋白VEGF與VEGFR2表達水平，影響玻璃體的通透性，降低視網膜電圖波幅，可導致糖尿病視網膜病變大鼠體重降低，促使血糖持續升高。