胃泌素釋放肽及其受體在兔耳增生性瘢痕組織中的表達及與瘢痕組織內巨噬細胞浸潤相關性研究

霍君藝，趙卓偉，段策中，劉佳慧，荊銀磊

(空軍軍醫大學唐都醫院燒傷整形科，陜西 西安 710038)

增生性瘢痕(Hyperplastic scar)，也被稱作肥厚性瘢痕，是真皮或者深部組織損傷或病變后，由新生結締組織過度增生修復而引起的一種隆起、表面光滑的暗紅色腫物，外觀形狀走勢與外傷傷口或創面一致[1]。盡管大部分增生性瘢痕并不會威脅患者生命安全，而且會隨時間的推移逐漸萎縮和癥狀變輕，但其會嚴重影響患者外觀和日常生活，給患者帶來心理疾病。目前，臨床上對增生性瘢痕的治療主要包括藥物治療、手術治療和物理治療等，然而無論哪種治療方式目前在臨床上都不成熟，其臨床療效均不確切，主要原因是對增生性瘢痕形成機制不明確[2-3]。研究[4-6]發現，神經肽是增生性瘢痕形成過程的促進物質，在瘢痕組織中表達升高，是增生性瘢痕發生的主要原因之一。胃泌素釋放肽(Gastrin-releasing peptide，GRP)是神經肽的一種，其主要由感覺神經細胞合成并釋放，通過與胃泌素釋放肽受體(Gastrin-releasing peptide receptor，GRPR)結合而發揮介導脊髓中瘙癢感覺的產生[7-8]。崔婧博等[9]比較人瘢痕疙瘩組織和正常人表皮組織中GRP和GRPR的表達發現，人瘢痕疙瘩組織中GRP和GRPR表達升高，但其對瘢痕形成過程中發揮的具體作用的目前尚不清楚。本研究建立兔耳增生性瘢痕模型，通過檢測GRP和GRPR在不同時期兔耳增生性瘢痕中的表達情況，以探討其表達對增生性瘢痕形成的影響，并探討其具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性新西蘭兔，年齡1～1.2歲，體重2～2.5 kg，共計18只均購買自上海靈暢生物科技有限公司。所有新西蘭兔均被飼養在溫度為16～26 ℃，相對濕度40%～70%，通風以及12 h白晝條件下，在單籠適應性喂養1周后被隨機分為對照組、瘢痕A組和瘢痕B組進行實驗。

1.2 主要儀器與試劑 組織RNA提取試劑盒(RN002 plus，廣州佰匯生物科技有限公司)，反轉錄試劑盒(NH01047，廣州洛唯爾生物科技有限公司)，qPCR試劑盒(P917930,上海麥克林生化科技有限公司)，組織HE染色試劑盒(SL7070,北京酷來博科技有限公司)。皮膚活檢穿孔器(15110-40，PELCO)，生物顯微鏡(CX33，奧利巴斯)。

1.3 兔耳增生性瘢痕模型的建立 所有兔子在禁食12 h后，通過耳靜脈注射3%戊巴比妥鈉(1.5 mg/kg)進行麻醉，然后使用皮膚活檢打孔器在瘢痕A組每只兔子每個耳朵上制作一個直徑為0.6 cm創面，在瘢痕B組每只兔子每個耳朵制作一個直徑為1.0 cm的創面，充分熱凝止血。對照組每只兔子每個耳朵僅進行麻醉和熱凝，而不制作創面。

1.4 觀察指標

1.4.1 GRP、GRPR和F4/80 mRNA表達檢測：兔耳創面分別建立1個月(增生期)、2個月(消退期)和3個月(成熟期)時，隨機在每組選取3只兔子，安樂死后取兔耳瘢痕組織(對照組取對應部位正常表皮)，所有組織通過組織RNA提取試劑盒提取總RNA，然后使用反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄為cDNA，最后按照qPCR試劑盒說明配置qPCR反應體系以檢測GRP、GRPR和F4/80 mRNA表達。qPCR引物如下：GRP-F:5’-AGAGCGTCCAACTTCCTCAC-3’，GRP-R:5’-TGCAGCCCAAAGATCTCGAC-3’；GRPR-F:5’-GCTCTCCAAGGGTGATAGACG-3’，GRPR-R:5’-CCTTGTGCAATCAGCTCCCT-3’；F4/80-F:5’-ATCTGCAAGCCAGGAAGAGTC-3’，F4/80-R:5’-CTTGCTTGATGCTTTGGTCTGT-3’；β-actin-F:5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACG-3’，β-actin-R:5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATG-3’。

1.4.2 巨噬細胞浸潤檢測：兔耳創面分別建立1個月(增生期)、2個月(消退期)和3個月(成熟期)時，隨機在每組選取3只兔子，安樂死后取兔耳瘢痕組織(對照組取對應部位正常表皮)，所有組織均使用HE染色試劑盒進行HE染色，然后在顯微鏡下觀察，巨噬細胞呈圓形、橢圓形或不規則形狀、體積較大、核呈圓形或橢圓形、胞質內有時可見吞噬顆粒。

2 結 果

2.1 各組不同時期兔耳增生性瘢痕組織中GRP mRNA表達比較 見表1。GRP mRNA在增生期、消退期和成熟期兔耳增生性瘢痕組織的表達水平均顯著高于對照組正常兔耳表皮組織(均P<0.05)，并且GRP mRNA在瘢痕A組的表達水平低于瘢痕B組(P<0.05)。

表1 各組不同時期兔耳增生性瘢痕組織中GRP mRNA表達比較

2.2 各組不同時期兔耳增生性瘢痕組織中GRPR mRNA表達比較 見表2。GRPR mRNA在增生期、消退期和成熟期兔耳增生性瘢痕組織的表達水平均顯著高于對照組正常兔耳表皮組織(均P<0.05)，并且GRPR mRNA在瘢痕A組的表達水平低于瘢痕B組(P<0.05)。

表2 各組不同時期兔耳增生性瘢痕組織中GRPR mRNA表達比較

2.3 各組不同時期兔耳增生性瘢痕組織中F4/80 mRNA表達比較 見表3。F4/80 mRNA在增生期、消退期和成熟期兔耳增生性瘢痕組織的表達水平均顯著高于對照組正常兔耳表皮組織(均P<0.05)，并且F4/80 mRNA在瘢痕A組的表達水平低于瘢痕B組(P<0.05)。

表3 各組不同時期兔耳增生性瘢痕組織中F4/80 mRNA表達比較

2.4 GRP、GRPR與兔耳增生性瘢痕組織中F4/80表達的相關性 見表4。在瘢痕A組、瘢痕B組增生期，兔耳增生性瘢痕組織中F4/80 mRNA表達水平與GRP、GRPR均呈正相關(P<0.05)。

表4 兔耳增生性瘢痕組織中F4/80表達與GRP、GRPR表達的相關性

2.5 各組不同時期兔耳增生性瘢痕組織中巨噬細胞浸潤數目比較 見表5。在增生期、消退期和成熟期兔耳增生性瘢痕組織中浸潤巨噬細胞數目均顯著高于對照組正常兔耳表皮組織(均P<0.05)，且瘢痕A組兔耳增生性瘢痕組織中巨噬細胞浸潤數目低于瘢痕B組(P<0.05)。

表5 各組不同時期兔耳增生性瘢痕組織中巨噬細胞浸潤數目比較(個/高倍視野)

2.6 GRP、GRPR與兔耳增生性瘢痕組織中浸潤巨噬細胞數目的相關性 見表6。在瘢痕A組、瘢痕B組增生期，兔耳增生性瘢痕組織浸潤的巨噬細胞數目與GRP、GRPR均呈正相關(均P<0.05)。

表6 兔耳增生性瘢痕組織中浸潤巨噬細胞數目與GRP、GRPR表達的相關性

3 討 論

增生性瘢痕，是目前最常見的瘢痕類型之一，對于深及真皮深層的傷口形成增生性瘢痕風險較大，并且亞洲人群風險高于其他人群。灼痛和瘙癢感是增生性瘢痕形成過程中最明顯的臨床特征，然而對于增生性瘢痕形成過程中灼痛和瘙癢感產生的原因目前尚無一致的觀點。研究[10-11]發現，在皮膚出現創傷時，感覺神經和自主皮膚神經就會合成和分泌神經肽，包括降鈣素基因相關肽(CGRP)、P物質、神經激肽A和血管活性腸肽(VIP)；這些神經肽在傷口愈合的不同階段發揮不同的功能，比如在傷口炎癥期神經肽發揮促進炎癥細胞因子表達和分泌的功能，在瘢痕形成的過程中，神經肽又會刺激脊髓背根神經節以產生瘙癢感覺。總之，由感覺神經和自主神經纖維分泌的許多神經肽在傷口愈合的不同階段均起著重要作用。

GRP是一種由神經和內分泌來源的細胞分泌的神經肽，由27個氨基酸組織，最初是從豬的胃組織中被分離出[8-9]。研究[12-13]發現，GRP廣泛分布于中樞和外周神經系統，它可以促進角質形成細胞的遷移、增殖和血管生成，刺激角質形成細胞的增殖和遷移，在瘢痕組織形成的過程中發揮重要作用。為研究胃泌素釋放肽及其受體在增生性瘢痕組織中的作用，本研究建立兔耳增生性瘢痕組織模型，并在增生性瘢痕的不同階段檢測GRP和GRPR的表達，結果發現：GRP和GRPR mRNA在增生期、消退期和成熟期兔耳增生性瘢痕組織的表達水平均顯著高于對照組正常兔耳表皮組織，并且兔耳創面越大GRP和GRPR mRNA表達越高，GRP和GRPR隨兔耳創面愈合時間延長表達降低，這一結果與崔婧博[9]和邱欣等[14]的研究結果一致。崔婧博等[9]在人瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中檢測GRP和GRPR表達發現，GRP和GRPR在人瘢痕疙瘩中的表達水平顯著高于正常皮膚，與本次研究不同的是：崔婧博等并未研究瘢痕形成不同時期GRP和GRPR表達情況；而邱欣等[14]研究發現，YAP蛋白在兔耳增生性瘢痕的不同時期表達不同，并且與創面呈正相關，表明YAP蛋白與兔增生性瘢痕的形成有關。結合本研究結果表明，GRP和GRPR參與到增生性瘢痕形成的過程中。

進一步分析可知：GRP和GRPR在近年來被大量報道與炎癥性疾病的發生發展有關[15-16]，而持續局部炎癥和過多的膠原蛋白沉積是增生性瘢痕的主要特征[17-18]；并且傷口處炎癥強度與最終瘢痕形成的面積呈正相關，這也可以解釋GRP和GRPR在創面較大的瘢痕B組表達水平顯著高于創面較小的瘢痕A組。此外，之前的研究[19]還發現，GRP被發現可以促進纖維化細胞的增殖和纖維化的形成，而組織纖維化和膠原蛋白的過度沉積是增生性瘢痕形成的先決條件。因此，根據本研究結果和之前的研究結論，我們推測GRP和GRPR通過參與調節傷口愈合過程中的炎性反應和纖維化細胞的增殖影響增生性瘢痕的形成。

為進一步研究GRP和GRPR調控增生性瘢痕形成的分子機制，本研究分析GRP和GRPR與不同時期增生性瘢痕組織內巨噬細胞浸潤的相關性，結果發現：GRP和GRPR mRNA表達水平與F4/80 mRNA表達水平、巨噬細胞浸潤數目均呈正相關。炎癥細胞是炎性反應的執行者，浸潤的炎癥細胞在傷口愈合和增生性瘢痕形成的過程中發揮著重要作用，尤其是巨噬細胞[20]。巨噬細胞參與創面修復和瘢痕形成的全過程，其不僅可以在傷口愈合初期幫助吞噬病原微生物、壞死組織以促進傷口愈合，還在瘢痕形成過程中通過分泌TGF-β、血小板衍生生長因子以及堿性成纖維細胞生長因子等膠原物質促進瘢痕的形成[20]。而GRP和GRPR在兔耳增生性瘢痕形成的不同時期與增生性瘢痕組織內浸潤的巨噬細胞數目呈正相關，這表明GRP和GRPR也參與到創面修復和瘢痕形成的全過程。

綜上所述，GRP和GRPR在兔耳增生性瘢痕組織內表達升高，并且其表達升高與創面大小有關，均隨創面愈合而降低，且與增生性瘢痕組織內巨噬細胞浸潤呈正相關。