環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法在機(jī)械通氣患者下呼吸道病原體檢測(cè)中的應(yīng)用

劉佳佳 孫靜娜 閆海洋 韓振剛 陳靜 趙帥

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)中心，河北石家莊 050031

機(jī)械通氣患者病情危重，機(jī)體抵抗力明顯下降，尤其是有創(chuàng)機(jī)械通氣，極易發(fā)生院內(nèi)肺部感染，如何在短時(shí)間內(nèi)獲取病原微生物的信息廣受關(guān)注。傳統(tǒng)培養(yǎng)法需要3～5 d 獲得目標(biāo)菌和藥敏結(jié)果，環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）作為一種新型檢測(cè)技術(shù)，無(wú)需高溫變性、低溫退火過(guò)程，可在2 h 內(nèi)完成常見(jiàn)下呼吸道病原菌及耐藥基因檢測(cè)[1-2]。恒溫?cái)U(kuò)增芯片采用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與微流體芯片技術(shù)相結(jié)合設(shè)計(jì)而成的芯片，可同時(shí)檢測(cè)多種耐藥基因，針對(duì)性和特異度良好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便[3-4]。恒溫?cái)U(kuò)增芯片法技術(shù)核心主要在于等溫?cái)U(kuò)增、微流控芯片和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)[5-6]。其中，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可幫助有效簡(jiǎn)化儀器操作，大幅度加快檢測(cè)速度[7-9]。微流控芯片技術(shù)則主要保障反應(yīng)微腔體物理分隔良好，避免相互污染，且使用一次性、封閉反應(yīng)微腔體，可以有效杜絕核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的污染以此保障恒溫?cái)U(kuò)增可以便捷高效地進(jìn)行[10-12]。實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)靈敏度極高，結(jié)合人工智能判讀軟件，可自動(dòng)計(jì)算判定結(jié)果，縮短檢測(cè)周期[13-14]。本研究對(duì)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測(cè)經(jīng)氣管插管機(jī)械通氣患者下呼吸道病原體及耐藥基因的情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2021 年1 月至6 月90 例新轉(zhuǎn)入河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科及重癥監(jiān)護(hù)室行經(jīng)氣管插管機(jī)械通氣合并通氣后下呼吸道感染患者肺泡灌洗液標(biāo)本。其中男62 例，女28 例；年齡16～95 歲，平均（63.42±7.21）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：合并咳嗽、咳痰及肺部濕啰音，經(jīng)胸部CT 或胸部平片檢查證實(shí)存在下呼吸道感染，且經(jīng)氣管插管吸痰，以白細(xì)胞數(shù)＞25×109個(gè)/低倍視野，且上皮細(xì)胞＜10 個(gè)/低倍視野為標(biāo)本合格。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并病毒性肺炎；合并肺部真菌感染；肺結(jié)核；標(biāo)本不合格。標(biāo)本合格標(biāo)準(zhǔn)：多形核白細(xì)胞＞25×109個(gè)/低倍鏡視野，鱗狀上皮細(xì)胞＜10 個(gè)/低倍鏡視野。

1.2 主要儀器和試劑

iChip-400 多通道核酸檢測(cè)系統(tǒng)（天津百康芯公司）；呼吸道病原菌核酸檢測(cè)（恒溫?cái)U(kuò)增芯片法）試劑盒（成都博奧晶芯生物科技有限公司，批號(hào)：202002031）；全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀（迪爾96-Ⅱ）；Megafuge ST1R Plus 離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司，離心半徑為10 cm）。

1.3 檢測(cè)方法

所有患者均經(jīng)氣管插管吸痰取肺泡灌洗液標(biāo)本；所有樣本均分為兩份，一份加入等量4%NaOH，混勻后室溫液化，采用試劑盒行核酸提取，以恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測(cè)耐藥基因，隨后按照核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系，進(jìn)行核酸靶序列擴(kuò)增及檢測(cè)。于檢測(cè)頁(yè)面中錄入樣本信息，根據(jù)軟件設(shè)計(jì)對(duì)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，采用ROC法計(jì)算待測(cè)指標(biāo)參考值。另一份行細(xì)菌培養(yǎng)，于采樣后2 h 內(nèi)進(jìn)行血平板和巧克力平板接種，35℃、5%二氧化碳恒溫箱孵育48 h 后，使用自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀進(jìn)行鑒定及藥敏檢測(cè)。

1.4 觀察指標(biāo)

根據(jù)芯片反應(yīng)池分布情況，分析患者耐甲氧西林葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌屬、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎鏈球菌、肺炎衣原體、肺炎支原體等病原體檢出情況；同時(shí)分析KPC、IMP、NDM、VIM、OXA-48/23、mecA、VanA、VanB 等耐藥基因檢出情況；比較環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法與藥敏試驗(yàn)匹配情況。

樣本檢測(cè)符合率情況分析：若樣本檢測(cè)耐藥基因陽(yáng)性，且同時(shí)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果提示該樣本對(duì)此耐藥基因相應(yīng)藥物耐藥，則提示兩者檢測(cè)結(jié)果符合；若樣本檢測(cè)耐藥基因陽(yáng)性，但細(xì)菌培養(yǎng)或藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該樣本對(duì)此耐藥基因相應(yīng)藥物敏感，或細(xì)菌培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)顯示樣本對(duì)耐藥基因相應(yīng)藥物耐藥，但樣本檢測(cè)結(jié)果顯示耐藥基因陰性，則記為檢測(cè)結(jié)果不符合[15-17]。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法病原體檢測(cè)情況

共檢測(cè)標(biāo)本90 例，環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本69 例，標(biāo)本陽(yáng)性率為76.67%。未檢出卡他莫拉菌屬、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎衣原體、肺炎支原體。見(jiàn)表1。細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)標(biāo)本陽(yáng)性31 例，標(biāo)本陽(yáng)性率為34.44%。嗜麥芽窄食單胞菌、卡他莫拉菌屬、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎衣原體、肺炎支原體未檢出。見(jiàn)表2。

表1 不同方法病原體檢測(cè)情況[例（%）]

2.2 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法耐藥基因檢測(cè)情況

本藥敏試驗(yàn)主要針對(duì)KPC、IMP、NDM、VIM、OXA-48/23、mecA、VanA、VanB 這8 種耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，其中KPC、IMP、NDM、VIM、OXA-48/23 為耐碳青霉素類耐藥基因，OXA-23 曾被作為某些腸桿菌治療的首選藥物，OXA-48/23 均是導(dǎo)致細(xì)菌耐碳青霉素類耐藥的主要原因；mecA 為耐甲氧西林葡萄球菌標(biāo)志性基因，耐甲氧西林葡萄球菌耐藥性極強(qiáng)，一般情況下認(rèn)為檢出mecA 即為耐甲氧西林葡萄球菌陽(yáng)性；VanA為耐萬(wàn)古霉素及替考拉寧類耐藥基因，VanB 則為耐萬(wàn)古霉素類耐藥基因，其中VanA 和VanB 為腸球菌中檢測(cè)的耐藥基因。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法耐藥基因陽(yáng)性檢出率為86.67%（78/90），其中mecA、OXA-48、OXA-23 為檢測(cè)率最高的3 種耐藥基因。見(jiàn)表2。

表2 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法耐藥基因檢測(cè)情況

2.3 細(xì)菌培養(yǎng)法耐藥基因檢測(cè)情況

細(xì)菌培養(yǎng)法標(biāo)本陽(yáng)性31 例，耐藥試驗(yàn)檢測(cè)耐藥頻率最高依次為碳青霉素類、青霉素類、萬(wàn)古霉素類、替考拉寧類。見(jiàn)表3。

表3 細(xì)菌培養(yǎng)法耐藥基因檢測(cè)情況

2.4 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法與細(xì)菌培養(yǎng)符合情況分析

以每個(gè)樣本為單獨(dú)整體，分析環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法耐藥基因檢出情況與細(xì)菌培養(yǎng)法藥敏試驗(yàn)?zāi)退幥闆r，環(huán)介導(dǎo)溫?cái)U(kuò)增芯片法在mecA、OXA-48、OXA-23 等耐藥基因的檢測(cè)上具有較高檢出率，且與耐藥檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)符合率高，在耐甲氧西林葡萄球菌耐藥基因mecA 和耐碳青霉素耐藥基因OXA-48/23 檢測(cè)中，符合率可達(dá)100%。

3 討論

細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)一直以來(lái)都是檢測(cè)病原體耐藥性的金標(biāo)準(zhǔn)，但其在檢測(cè)靈敏度、檢測(cè)周期等方面往往難以滿足臨床工作的需求，且其可檢測(cè)的耐藥基因較為單一[18-20]。近年來(lái)，隨著分子檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，耐藥基因檢測(cè)應(yīng)用日益廣泛，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)病原體和耐藥基因，且特異度高的檢測(cè)技術(shù)，成為臨床需求的首選。

LAMP 對(duì)減少呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的發(fā)生，防止多重耐藥菌傳播，指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要的指導(dǎo)意義[21]。為明確恒溫?cái)U(kuò)增芯片法技術(shù)在機(jī)械通氣下呼吸道感染患者病原體及耐藥基因檢測(cè)中的應(yīng)用，在保障樣本不受上呼吸道菌群及口腔菌群的污染下[22]。本研究結(jié)果顯示，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法病原體陽(yáng)性標(biāo)本69 例，陽(yáng)性率為76.67%，下呼吸道分泌物樣本中細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率（34.44%）明顯低于恒溫?cái)U(kuò)增芯片法，其檢出病菌31 株，檢出率最高前6 位分別為鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌，與既往研究[23]中重癥監(jiān)護(hù)室細(xì)菌種類及分布情況相近。恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢出的病原菌分布與細(xì)菌培養(yǎng)法有一定差異，國(guó)內(nèi)其他通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)法研究下呼吸道感染的研究多以銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等為主要致病菌，猜測(cè)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法和細(xì)菌培養(yǎng)法的檢測(cè)差異可能與細(xì)菌培養(yǎng)法的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)條件受限有關(guān)，提示恒溫?cái)U(kuò)增芯片法對(duì)于反映機(jī)械通氣合并下呼吸道感染真實(shí)性更高[24-25]。

本研究環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法陽(yáng)性檢出率為86.67%，其中mecA、OXA-48、OXA-23 檢測(cè)率最高，在本研究中未行腸球菌檢測(cè)，故VanA 和VanB 檢出率為0。王詠紅等[26]研究指出，以細(xì)菌培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，采用芯片法測(cè)出的很多陽(yáng)性患兒會(huì)被判定為假陽(yáng)性，導(dǎo)致芯片法的特異性低，采用細(xì)菌培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判芯片法的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值會(huì)存在誤差。基于此，本研究采用兩種不同方法進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，結(jié)果顯示，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法對(duì)常規(guī)耐藥基因的陽(yáng)性檢出率明顯高于傳統(tǒng)藥敏檢測(cè)，且部分樣本存在兩個(gè)和/或兩個(gè)以上耐藥基因陽(yáng)性情況。一方面提示恒溫?cái)U(kuò)增芯片法對(duì)于耐藥基因檢測(cè)敏感性高，特異性強(qiáng)，一方面也提示臨床抗菌用藥，需要考慮聯(lián)合感染并慎重給藥。以每個(gè)樣本為單獨(dú)整體，分析恒溫?cái)U(kuò)增芯片法耐藥基因檢出情況與細(xì)菌培養(yǎng)法藥敏試驗(yàn)?zāi)退幥闆r。結(jié)果顯示，溫?cái)U(kuò)增芯片法耐藥基因陽(yáng)性檢出率為86.67%（78/90），且其在mecA、OXA-48、OXA-23 等耐藥基因的檢測(cè)上均具有較高檢出率，與此同時(shí)，細(xì)菌培養(yǎng)法藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，樣本耐藥頻率最高依次為碳青霉素類、青霉素類、萬(wàn)古霉素類，上述3 類耐藥基因相應(yīng)抗生素在臨床上也是最常用于抗感染治療的藥物，其相關(guān)藥物是否耐藥對(duì)于指導(dǎo)臨床抗生素的正確使用具有積極意義。其中碳青霉素類藥物出現(xiàn)頻率在40%以上，與耐藥基因檢出結(jié)果比較，耐藥檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)符合率高，但對(duì)于耐藥基因數(shù)量及耐藥性的檢測(cè)還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析。

與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法比較，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法對(duì)于檢測(cè)機(jī)械通氣合并下呼吸道感染患者分泌液病原體具有高陽(yáng)性檢出率，其耐藥基因檢測(cè)特異性好，對(duì)于指導(dǎo)臨床藥物干預(yù)具有積極作用。