通竅益腦方對東莨菪堿癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶行為的影響

阿力努爾·艾麥爾 聶雨楠 阿娜古麗·馬合木提 高莉

1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所 新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830049

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年人中最常見的致死性神經(jīng)退行性疾病[1-2]，通常表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶力下降，伴隨或隨后出現(xiàn)的其他認(rèn)知功能障礙，如視覺空間異常、導(dǎo)航困難、執(zhí)行問題和語言障礙等[3]。隨著人口老齡化的加劇，其發(fā)病率呈增高趨勢，因此AD 也成為不能忽視的公共衛(wèi)生問題，給家庭和社會造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。目前臨床上治療AD的藥物主要有多奈哌齊、鹽酸美金剛片等，而這些藥物均是以改善癥狀為主，并不能延緩或終止疾病的進(jìn)展[5]，故仍需探索預(yù)防及延緩其發(fā)病進(jìn)程或改善癥狀的藥物。

本研究所用的通竅益腦方是由薰衣草、水龍骨、余甘子、牛舌草等幾味藥材配伍而成。研究證實(shí)這些藥材具有抗氧化[6-12]、預(yù)防心腦血管疾病、降血脂[9-10]、保肝[10]、抗細(xì)胞凋亡[11,13]等功效。本研究建立東莨菪堿模型，觀察通竅益腦方對東莨菪堿模型小鼠學(xué)習(xí)記憶行為及對腦內(nèi)乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）、乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltransferase，ChAT）含量的影響，探討其對獲得性短暫記憶障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶行為的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康SPF 級雄性昆明小鼠50 只，體重（20±2）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2018-0002。小鼠分籠飼養(yǎng)，12 h/12 h 白天和黑夜循環(huán)照明，自由飲水和進(jìn)食。飼養(yǎng)溫度為21～25℃，濕度為40%～60%。本研究經(jīng)新疆維吾爾醫(yī)藥研究所動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥品與試劑

通竅益腦方（新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所自制）；氫溴酸東莨菪堿（Sigma 公司，批號：P1736201）；ACh 測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：20201 223）；AChE 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20201224）；ChAT 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（江萊生物，批號：JL20662）。

1.3 儀器

SQP 型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，稱量范圍：0.01～120 g）；YLS-3TB 型跳臺記錄儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；1510 型全波長酶標(biāo)儀（Thermo Fester Scientific）；TL2010S 高通量組織研磨儀（SOP-EQ036）；SPX-150B-Z 恒溫生化培養(yǎng)箱。

1.4 動物分組、給藥與模型制備

采用隨機(jī)數(shù)字表法將50 只小鼠分為空白對照組、東莨菪堿模型組、多奈哌齊組、通竅益腦方0.41 g/kg組、通竅益腦方0.82 g/kg 組，每組10 只。各組按劑量連續(xù)灌胃給藥29 d，空白對照組與東莨菪堿模型組給予相同劑量的溶媒。除空白對照組外，其他各組行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前30 min 腹腔注射2 mg/kg 東莨菪堿造模，空白對照組腹腔注射生理鹽水[14-15]。

1.5 跳臺試驗(yàn)

給藥第27～28 天進(jìn)行跳臺試驗(yàn)。跳臺實(shí)驗(yàn)分為兩個階段：訓(xùn)練期和測試期。訓(xùn)練期將小鼠放入箱內(nèi)適應(yīng)3 min，然后立即通以36 V、2 mA 交流電，小鼠在受到電擊后回到平臺，多數(shù)動物可能會多次下臺受到電擊再回到平臺，這是小鼠學(xué)習(xí)找臺逃避電擊的過程。如此訓(xùn)練5 min 記錄實(shí)驗(yàn)小鼠第一次跳下絕緣平臺的時間，為下臺潛伏期；小鼠跳下絕緣平臺遭受電擊的次數(shù)，即下臺錯誤次數(shù)作為學(xué)習(xí)成績。24 h 后重復(fù)測試，記錄下臺潛伏期和下臺錯誤次數(shù)作為記憶成績[16-17]。

1.6 ACh、ChAT 含量及AChE 活力測定

給藥第29 天斷頭取腦，用生理鹽水沖洗大腦皮層表面血液然后在冰袋上分離海馬組織。根據(jù)試劑盒說明書對海馬組織進(jìn)行預(yù)處理并檢測小鼠海馬中的ACh、ChAT 含量及AChE 活力。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差比較分析或t 檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組跳臺試驗(yàn)結(jié)果比較

與空白對照組比較，在跳臺試驗(yàn)的訓(xùn)練期和測試期，東莨菪堿模型組下臺潛伏期縮短，下臺錯誤次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）；與東莨菪堿模型組比較，在跳臺試驗(yàn)的訓(xùn)練期和測試期，通竅益腦方0.41 g/kg 組、通竅益腦方0.82 g/kg 組下臺潛伏期延長，下臺錯誤次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）；在跳臺試驗(yàn)的訓(xùn)練期和測試期，通竅益腦方0.41 g/kg 組與通竅益腦方0.82 g/kg 組下臺潛伏期、下臺錯誤次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組跳臺試驗(yàn)結(jié)果比較（n=10）

2.2 各組ACh、ChAT 含量及AChE 活力比較

與空白對照組比較，東莨菪堿模型組ACh、ChAT含量下降，AChE 活力升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）；與東莨菪堿模型組比較，通竅益腦方0.41 g/kg組、通竅益腦方0.82 g/kg 組ACh、ChAT 含量升高，AChE 活力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）；通竅益腦方0.41 g/kg 組與通竅益腦方0.82 g/kg 組ACh、ChAT 含量，AChE 活力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組ACh、ChAT 含量及AChE 活力比較（n=10）

3 討論

研究表明，膽堿能突觸在人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中無處不在[18]。他們在丘腦、紋狀體、邊緣系統(tǒng)和新皮質(zhì)中的高密度表達(dá)表明膽堿能的傳遞可能對記憶、學(xué)習(xí)、注意力和其他高級大腦功能至關(guān)重要[19-20]，而中樞膽堿能系統(tǒng)功能損傷是導(dǎo)致AD 的重要發(fā)病機(jī)制[21]。ACh 是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，突觸前膜ACh 的合成、ChAT 酶活性、AChE 活性都與AD 患者學(xué)習(xí)記憶能力的損傷有關(guān)[22]。

AD 患者腦內(nèi)ACh 含量普遍偏低，這可能是形成AD 的主要原因之一[23]。東莨菪堿是M 受體阻斷藥，特異性抑制大腦1 級記憶轉(zhuǎn)變成2 級記憶的過程，干擾近期記憶的形成，從而模擬AD 膽堿能系統(tǒng)受損，一直被廣泛用于AD 機(jī)制研究及藥物開發(fā)[24]。因此，本研究使用腹腔注射東莨菪堿造模，抑制中樞膽堿能系統(tǒng)，神經(jīng)元缺失后神經(jīng)遞質(zhì)ACh 減少，造成學(xué)習(xí)記憶功能受損，此種造模方法對記憶影響的機(jī)制較為明確，重現(xiàn)性較好，因此廣泛應(yīng)用[25-26]。

本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，東莨菪堿模型組在跳臺實(shí)驗(yàn)中下臺潛伏期縮短，下臺錯誤次數(shù)增加（P <0.05），提示造模成功，且造模過程中未出現(xiàn)小鼠死亡。本研究結(jié)果顯示，與東莨菪堿模型組比較，通竅益腦方0.41 g/kg 組、通竅益腦方0.82 g/kg 組ACh、ChAT 含量升高，AChE 活力下降（P <0.05），提示通竅益腦方作用于腦內(nèi)中樞膽堿能系統(tǒng)，但無法確定量效關(guān)系，因此還需要做進(jìn)一步研究確定量效關(guān)系、作用機(jī)制以及病理變化。