靈芝三萜提取工藝優化*

鄭苗欣，張振偉，王雪婷，周偉堅，莫轉林，莫美華**

（1.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.華南農業大學基礎實驗與實踐訓練中心，廣東 廣州 510642）

作為一種傳統中藥，靈芝（Ganoderma lucidum）在我國有悠久的應用歷史，具有抗腫瘤、抗衰老、免疫調節等多種功效[1-5]。靈芝三萜是其最主要的功能活性成分之一，具有抗氧化、保肝護肝、增強免疫等多種藥理作用[6-8]。

靈芝三萜主要是從子實體或孢子粉中獲取。然而相較于菌絲體的培養，子實體及孢子粉的生產都更為費時、費力，且成本較高，難以保證質量與產量[9]。不同靈芝子實體含有的三萜種類不同[10]，靈芝菌絲體提取的三萜中含有子實體和孢子粉三萜中所沒有的7-O-乙基靈芝酸O[11-12]。因此，靈芝液體發酵作為高效生產靈芝三萜的方法受到了國內外學者的廣泛關注[4，13-15]。

為優化靈芝三萜提取工藝，采用超聲輔助提取法提取靈芝三萜，通過正交試驗確定最佳工藝參數。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

靈芝菌株T0，由華南農業大學食品學院應用真菌試驗室保藏。

1.1.2 培養基

PDA培養基：馬鈴薯 200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、瓊脂 20 g·L-1，pH 自然。

液體培養基：葡萄糖 20 g·L-1、玉米粉 10 g·L-1、麥麩 10 g·L-1、蛋白胨 5 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、MgSO4·7H2O 2 g·L-1，pH 自然。

1.2 試驗儀器與試劑

1.2.1 主要儀器設備

SW-CJ-1D超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；DSX-280A/LDZX-40高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；LRH-150生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；KQ-500E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；101-3電熱鼓風干燥箱，上海錦屏儀器儀表有限公司；HH-2恒溫水浴鍋，江蘇金壇市宏華儀器廠；H2050R高速冷凍離心機，湖南湘儀試驗室儀器開發有限公司；YB-500A高速多功能粉碎機，上海力箭機械有限公司；AB204-N電子天平，上海Mettler-Toledo有限公司。

1.2.2 主要試劑

葡萄糖，廣州化學試劑廠；瓊脂，廣州環凱生物公司；磷酸二氫鉀，廣州化學試劑廠；硫酸鎂，天津市福晨試劑廠；蛋白胨，廣州展晨生物科技有限公司；齊墩果酸標準品，上海源葉生物科技有限公司；冰乙酸，天津市富宇精細化工有限公司；香草醛，福晨（天津）化學試劑有限公司。試劑均為分析純。

1.3 靈芝菌絲體的培養

1.3.1 菌種的活化培養

取活化的斜面菌種接種到PDA平板培養基上，放入26℃恒溫培養箱中培養至菌絲長滿平板。

1.3.2 液體發酵培養基的制備

使用1.1.2的液體培養基配方。玉米粉和麥麩加適量蒸餾水煮沸，用4層紗布過濾，將配方中其他成分加入濾液中溶解，并用蒸餾水定容。制備好的培養基裝入250 mL錐形瓶中，每瓶100 mL，加入15顆玻璃珠，121℃滅菌30 min，滅菌結束后冷卻備用。

1.3.3 接種和培養

用打孔器在長滿菌絲的平板培養基表面取直徑9 mm的圓片狀菌塊，接種到液體發酵培養基中，每瓶接種2塊；封口后放入26℃恒溫搖床中，160 r·min-1培養 10 d。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗材料預處理

取培養10 d的液體發酵產物，用蒸餾水充分清洗菌絲體6次，抽濾，收集菌絲體；置于55℃電熱鼓風干燥箱中，烘干至恒重；粉碎機粉碎，過80目篩。

1.4.2 靈芝菌絲體三萜的提取工藝

靈芝三萜的提取采用超聲輔助醇提法。精確稱取1 g靈芝菌絲體干粉，加入95%乙醇溶液30 mL，50℃超聲浸提30 min，冷卻至室溫；將提取液真空抽濾，濾渣用適量95%乙醇充分洗滌，合并濾液；轉移至100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，即為樣品總三萜提取液。

1.5 單因素試驗

1.5.1 乙醇濃度

精確稱取1 g靈芝菌絲體干粉，分別加入30 mL濃度為80%、85%、90%、95%、100%的乙醇溶液；50℃、500 W超聲浸提30 min，冷卻至室溫；提取液真空抽濾，濾渣用適量相同濃度的乙醇充分洗滌，合并濾液；轉移至100 mL容量瓶中，用相同濃度的乙醇定容至刻度。

1.5.2 提取時間

精確稱取1 g靈芝菌絲體干粉，加入30 mL95%的乙醇；50℃、500 W超聲浸提10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，冷卻至室溫；提取液真空抽濾，濾渣用適量95%乙醇充分洗滌，合并濾液；轉移至100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度。

1.5.3 料液比

精確稱取1 g靈芝菌絲體干粉，分別以料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 加入 95%的乙醇溶液；50℃、500 W超聲浸提30 min，冷卻至室溫；提取液真空抽濾，濾渣用適量95%乙醇充分洗滌，合并濾液；轉移至100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度。

1.6 正交優化試驗

1.6.1 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，確定乙醇濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C） 3個因素作為影響靈芝菌絲體三萜得率的工藝條件，設定3因素3水平正交試驗，試驗設計見表1。

表1 正交試驗因素水平Tab.1 Factor and level of orthogonal test

1.6.2 標準曲線的制作

以齊墩果酸標準品為對照品，采用香草醛-冰乙酸-高氯酸法繪制齊墩果酸標準曲線[16]。

1.6.3 靈芝菌絲體三萜的測定及得率的計算

精確量取1 mL樣品總三萜提取液，揮干乙醇后，采用和測定標準曲線相同的操作方法，在560 nm波長下測定吸光度值，按每100克菌絲體干粉中提取到的總三萜克數計算。樣品三萜得率（w，%）的計算公式為：

式中：Y為提取液中總三萜的質量（μg）；M為樣品的質量（mg）；V為樣品總三萜提取液的體積（mL）。

1.7 數據處理

數據計算與處理使用SPSS 26和DPS 7.05軟件，圖片的繪制使用Origin 2018。所有試驗均設3個重復。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對靈芝三萜得率的影響

不同乙醇濃度對靈芝三萜得率的影響見圖1。

圖1 乙醇濃度對靈芝菌絲體三萜得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of triterpenoid from Ganoderma lucidum mycelium

如圖1所示，當其他條件相同時，在80%～95%范圍內靈芝菌絲體三萜得率隨乙醇濃度的升高而顯著升高。三萜得率在乙醇濃度為95%時最高，為2.75%。靈芝中的三萜大都為醇溶性成分[17]，因而在相同體積下，乙醇濃度越高，三萜的得率越高。而當乙醇濃度為100%時，三萜得率低于95%乙醇濃度，推測原因可能為100%乙醇濃度未能將極性較高的水溶性三萜提取出來[18]。

2.1.2 提取時間對靈芝三萜得率的影響

不同提取時間對靈芝三萜得率的影響見圖2。

圖2 提取時間對靈芝菌絲體三萜得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of triterpenoid from Ganoderma lucidum mycelium

如圖2所示，當其他條件相同時，靈芝菌絲體三萜得率在50 min內隨提取時間延長而升高。提取前30 min三萜得率增長率較低；隨著物料與溶劑的充分接觸，三萜得率從30 min開始明顯提高；提取50 min時三萜得率最高，達到2.74%，但得率增長率有所下降。這可能是因為隨著時間的延長，除了三萜以外還有許多其他的物質被提取出來，給三萜的浸提增加了阻礙[19]。此外，也可能是因為隨著提取時間的延長，三萜的生物活性也在逐步喪失[20]。綜合考慮成本，靈芝菌絲體三萜的最優提取時間為40 min。

2.1.3 料液比對靈芝三萜得率的影響

不同料液比對靈芝三萜得率的影響見圖3。

圖3 料液比對靈芝菌絲體三萜得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of triterpenoid from Ganoderma lucidum mycelium

如圖3所示，當其他條件相同時，三萜得率在料液比為1∶30時最大，達到2.68%；之后隨著提取溶劑的增加，三萜得率呈現下降的趨勢；因此，提取靈芝菌絲體三萜的最優料液比為1∶30。由結果推測，當提取溶劑較少時不利于超聲的空化作用及其在溶劑中的傳播速度，靈芝菌絲體細胞壁未被完全破壞，故而三萜得率較低[21]。料液比為1∶40、1∶50時得率降低，可能是因為在相同功率下，提取溶劑的增加導致超聲無法完全破壞細胞壁，三萜無法完全溶出[22]；或是因為三萜已基本溶出細胞，胞外、胞內的三萜濃度相等[23]。

2.1.4 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，以乙醇濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）為變量，以靈芝菌絲體三萜得率為指標，進行正交試驗，具體試驗方案及結果見表2。

表2 正交試驗結果Tab.2 Results of orthogonal test

由表2可知，通過對極差R進行比較，判斷各因素對靈芝菌絲體三萜得率的影響順序是：A＞B＞C，即乙醇濃度＞提取時間＞料液比。在對k值進行對比后判斷3個因素的最佳組合是A2B2C3，即乙醇濃度85%、提取時間30 min、料液比1∶30。在此條件下進行驗證試驗，得到靈芝菌絲體三萜的平均得率為3.50%。

對正交試驗結果進行方差分析，見表3。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

由表3方差分析結果可知，乙醇濃度對三萜得率的影響顯著，提取時間、料液比的影響不顯著。

2.2 齊墩果酸標準曲線

根據1.6.2標準曲線的測定方法，以560 nm測得的吸光度值為橫坐標，齊墩果酸的質量為縱坐標繪制標準曲線，見圖4。

圖4 齊墩果酸標準曲線結果Fig.4 Standard curve of oleanolic acid

如圖4所示，三萜含量在0～100 μg范圍內有良好的線性關系。得到的齊墩果酸線性回歸方程為：

該回歸方程的相關系數R2為0.998 6。

3 討論與結論

劉奇等[23]研究發現，在單因素試驗中，當料液比為1∶30時，三萜得率達到最高，這與此次試驗得到的結果一致。推測當其他條件相同，而料液比為1∶30時，超聲所產生的強烈振動可使細胞壁完全破裂，三萜溶出量最大[21]。但乙醇濃度和提取時間的單因素試驗結果卻和其他報道有較大差異，比如鄭士彬[24]試驗得到的最佳乙醇濃度為75%，最佳提取時間為120 min；這可能與超聲功率和其他報道的試驗條件不同有關。另外，試驗使用的靈芝品種也不相同，不同品種的靈芝含有的三萜類型、含量具有很大差異[25-28]；而不同的提取條件會影響三萜的活性，且甾醇、皂苷、油酸等雜質的溶出也會影響結果[29-31]。

在此優化條件下靈芝菌絲體三萜平均得率為3.50%，高于正交試驗中其他提取條件下的結果，驗證條件可行。江和棟等[32]利用多種方法對靈芝孢子粉三萜進行提取，超聲提取工藝下三萜得率為3.51%，與本試驗中的三萜提取工藝相近，且三萜得率近乎相等。但劉奇等[23]通過正交試驗得到最優提取方案的三萜得率僅為0.71%；而劉世柱等[33]通過正交試驗得到最優提取方法的三萜得率達7.76%；可見三萜得率不僅與提取工藝有關，而且與選用的菌種有很大關系。不同的提取工藝對三萜得率有較大影響，但提取工藝對三萜結構是否會產生影響進而改變其功能活性的研究還尚未見相關報道，有待進一步探討。

靈芝三萜不僅具有廣泛的生理活性和良好的應用前景，且隨著人們對健康越來越重視，市場對靈芝三萜的需求量也在持續上升。雖然靈芝菌絲體液體發酵已大大減少了生產過程中所耗費的人力物力，但仍不足以滿足實際生產的需要。因此，試驗結果為進一步研究靈芝菌絲體三萜的提取工藝具有重要意義，也為靈芝三萜的開發奠定了良好的技術基礎。