蘆葦秸稈對靈芝液體發酵多糖產量的影響*

辛世紀，劉靜雯，班立桐，黃 亮，王 玉，孫 寧

（天津農學院農學與資源環境學院，天津 300384）

靈芝（Ganoderma lucidum），屬多孔菌科（Polyporaceae） 靈芝屬（Ganoderma），是常見的藥用真菌。研究表明，靈芝多糖的原料來源主要有人工栽培和液態發酵2種，其中人工栽培仍是目前靈芝多糖提取原料的主要來源[1]。靈芝液體發酵可以獲得靈芝的主要活性成分，同時液體發酵技術具有周期短、易操作、成本低、效益高等優點，且能夠大大提高靈芝活性成分的產量[2]，得到了國內外研究學者的廣泛關注[3-4]，對于靈芝工廠化生產更為有利。

靈芝多糖是靈芝最主要的活性成分之一，是一種活性很強、功能性齊全的天然糖類高分子化合物，是靈芝生長過程中奠基固本的重要因素之一，具有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基、抗病毒、功能性產品加工等價值[5-9]，具有更深層的開發潛力。

蘆葦，為禾本科多年生草本植物，在我國出產很豐富，具有很強的凈水能力，能夠大量吸附氮、磷、鉛、鉻等元素，是一種能夠創造巨大的生態價值和社會經濟效益的纖維植物。目前蘆葦在世界范圍內主要用于醫療保健、畜牧業、建筑工業、造紙和人造棉[10-11]。盡管國內對蘆葦的研究已經取得一定的進展，但目前蘆葦種群發生了前所未有的消退現象[12]，蘆葦資源的應用存在局限性。使用蘆葦秸稈作為靈芝液體培養的碳源，優化靈芝液體培養液的配方及培養條件，根據發酵液的胞外多糖產量優化其發酵工藝。既解決了蘆葦資源應用的局限性、秸稈廢棄物污染環境的問題，又為靈芝多糖的生產提供了新的可能，為蘆葦秸稈-靈芝液體發酵技術的開發提供了依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

靈芝菌株G8，保藏于天津農學院食用菌研發中心。

1.1.2 供試蘆葦秸稈

蘆葦秸稈，取自天津市薊州區于橋水庫前置庫。

蘆葦秸稈預處理方式：105℃殺青2 h后，放于80℃烘箱中烘干至恒重，自然冷卻至室溫后，用粉碎機粉碎，過60目篩，備用。

1.2 培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蛋白胨 3 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g、VB10.1 g，蒸餾水1 000 mL。

基礎發酵培養基：葡萄糖30 g、蛋白胨10 g、KH2PO41.5 g、MgSO40.75 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

1.3 試驗方法

1.3.1 高產多糖液體培養基配方單因素篩選

1）碳源篩選：基礎發酵培養基（無葡萄糖）分別添加蘆葦秸稈、玉米秸稈、小麥秸稈、水稻秸稈各5 g，以添加30 g葡萄糖為對照。搖床培養7 d，取樣檢測多糖產量，確定最適秸稈種類。

2）碳源添加量：將蘆葦秸稈加入基礎發酵培養基中，作為發酵液唯一碳源。以不加葡萄糖的基礎發酵培養基為對照，蘆葦秸桿在培養基中的配比分別設置為0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%。搖床培養7 d，取樣檢測多糖產量。

3）氮源篩選：基培發酵培養基（無蛋白胨）分別添加尿素6 g、硫酸銨7 g、硝酸銨4 g、酵母浸粉7 g，以添加10 g蛋白胨為對照，進行靈芝液體培養。搖床培養7 d，取樣檢測多糖產量。

4）氮源添加量：確定最佳氮源后，設置不同最佳氮源配比分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%。搖床培養7 d，取樣檢測多糖產量。

5）初始pH：最優培養條件在未發酵前調節發酵液pH，分別設置pH為3、4、5、6、7、8。

6）轉速：在最優培養條件下設置搖床培養的不同轉速，分別為 110 r·min-1、130 r·min-1、150 r·min-1、170 r·min-1、190 r·min-1。

7） 溫度：設置不同培養溫度，分別為23℃、25℃、27℃、29℃、31℃。

1.3.2 靈芝液體發酵胞外粗多糖產量測定方法

取搖床培養至第7天的發酵液為測定對象，檢測靈芝胞外多糖產量。

發酵液過8層紗布，取過濾后的發酵液20 mL，4 000 r·min-1離心10 min。處理后的過濾液取5 mL于潔凈干燥的離心管中，緩慢加入4倍體積的無水乙醇并攪拌均勻，于4℃靜置醇沉24 h，每12小時搖勻。醇沉后將離心管置于6 000 r·min-1條件下離心8 min，倒去上清液，取沉淀。置于烘干箱中烘干至恒重，稱重計算其多糖含量[13-14]。

1.3.3 高產多糖液體培養基配方正交試驗設計

根據單因素篩選試驗，確定以每升液體培養基中蘆葦秸稈和硫酸銨的添加量及pH為因素，設計L9（33）的正交試驗，正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平設計表Tab.1 Horizontal design of orthogonal test factors

2 結果與分析

2.1 高產靈芝多糖液體培養基單因素篩選試驗

2.1.1 不同碳源對液體培養泰山靈芝多糖產量的影響

選用不同的秸稈作為碳源，對泰山靈芝液體培養生產多糖的影響見圖1。

圖1 不同碳源條件下靈芝液體培養多糖產量的比較Fig.1 Comparison of the yield of polysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different carbon sources

如圖1所示，添加不同秸稈種類作為培養基碳源均對靈芝多糖產生有促進作用，且靈芝的多糖產量明顯高于對照組；而添加蘆葦秸稈的培養基中多糖產量大于添加其他種類秸稈的處理。多糖含量順序依次為：蘆葦秸稈（2.22 g·L-1）＞小麥秸稈（2.09 g·L-1）＞玉米秸稈（2.01 g·L-1）＞水稻秸稈（1.86 g·L-1）＞對照組（1.46 g·L-1）。因此，選擇蘆葦秸稈作為唯一碳源。

2.1.2 碳源配比對液體培養泰山靈芝多糖產量的影響

蘆葦秸稈作為碳源，其不同配比對液體培養泰山靈芝多糖產量的影響見圖2。

圖2 不同蘆葦秸稈添加量下靈芝液體培養多糖產量的比較Fig.2 Comparison of the yield of polysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different amounts of reed straw addition

如圖2所示，液體培養泰山靈芝G8多糖產量最高的處理為添加0.5%蘆葦秸稈，其次為添加3%蘆葦秸稈；0.5%處理下多糖產量最多，達2.47 g·L-1，3%處理為2.31 g·L-1。由于碳源是作為靈芝生長的最主要營養成分，也是促進液體發酵時靈芝多糖產出的主要因素之一，故選擇蘆葦秸稈添加量為正交試驗的因素。

2.1.3 不同氮源對液體培養泰山靈芝多糖產量的影響

使用不同氮源對液體培養泰山靈芝多糖產量的影響見圖3。

圖3 不同氮源條件下靈芝液體培養多糖產量的比較Fig.3 Comparison of the yield of polysaccharides produced by liquidcultivation of Ganoderma lucidum under different nitrogen sources

如圖3所示，靈芝液體發酵條件對不同氮源的利用情況有較大差異。其中，酵母浸粉、硫酸銨的利用效果相對較高，蛋白胨、尿素的利用效果次之，硝酸銨利用效果最低。以硫酸銨為氮源的試驗組多糖產量最大，為3.49 g·L-1。因此硫酸銨更有利于靈芝液體發酵時多糖的產生。

2.1.4 氮源配比對液體培養泰山靈芝多糖產量的影響

選用硫酸銨作為氮源，其不同配比對液體培養泰山靈芝多糖產量的影響見圖4。

圖4 不同硫酸銨添加量條件下靈芝液體培養多糖產量的比較Fig.4 Comparison of the yield of polysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different ammonia sulfate additions

如圖4所示，隨著氮源添加量的增大，靈芝發酵液的多糖產量呈現先增后減的趨勢；配比為0.7%～1.3%時，多糖產量較大；其中，氮源配比為1%時多糖產量最大。在不同氮源添加量條件下，靈芝發酵的多糖產量各不相同，因此篩選合適的氮源添加量在提高靈芝發酵多糖產量上有較大的影響。因此，選擇氮源添加量作為正交試驗的因素之一。

2.1.5 不同初始pH對液體培養泰山靈芝多糖產量的影響

培養基不同初始pH對液體培養泰山靈芝多糖產量的影響見圖5。

圖5 不同初始pH條件下靈芝液體培養多糖產量的比較Fig.5 Comparison of theyieldofpolysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different initial pH conditions

如圖5所示，隨著pH的增大，多糖含量呈現先升高后降低的趨勢；pH 7時多糖產量最大，為3.99 g·L-1。pH和溶解氧（DO） 是影響深層液態發酵靈芝菌絲體生長、代謝和靈芝多糖產生的重要因數，但目前對靈芝發酵過程中pH的研究都著眼于調節發酵初始pH，對發酵過程中的pH一般不作控制[15]。故選取初始pH作為正交試驗的因素之一。

2.1.6 不同溫度對液體培養泰山靈芝多糖產量的影響

不同培養溫度對液體培養泰山靈芝多糖產量的影響見圖6。

圖6 不同溫度條件下靈芝液體培養多糖產量的比較Fig.6 Comparison of theyieldofpolysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different temperature conditions

如圖6所示，當溫度為27℃時多糖產量最大，為3.92 g·L-1。有研究表明，靈芝液體發酵的最適溫度為28℃[16]，可見最適溫度與文獻報道相近。因此，溫度可以作為靈芝液體培養的穩定條件。

2.1.7 不同轉速對液體培養泰山靈芝多糖產量的影響

液體搖瓶培養泰山靈芝時，不同轉速對多糖產量的影響見圖7。

圖7 不同轉速條件下靈芝液體培養多糖產量的比較Fig.7 Comparison of theyieldofpolysaccharides produced by liquid cultivation of Ganoderma lucidum under different rotational speeds

由圖7所示，當轉速為170 r·min-1時多糖產量最大，為4.53 g·L-1。經分析該處理具有顯著性差異。轉速的變化可以改變溶氧和剪切力的變化，剪切力過大或溶氧不足都會對菌絲體的生長造成不良影響；適當提高轉速能夠增大發酵過程中的溶氧性，有利于靈芝產糖的積累[17]。轉速不宜過高或過低，因此為達到穩定的培養條件，選擇170 r·min-1轉速為靈芝液體培養條件。

2.2 正交試驗結果分析

正交試驗結果分析見表2。

表2 正交試驗結果Tab.2 Analysis of orthogonal test results

由表2可知，最佳的培養基配方為A1B3C3；即每升液體培養基中蘆葦秸稈的添加量為10 g，其配比為0.3%，每升液體培養基中硫酸銨的添加量為13 g，其配比為1.3%，pH為8。最佳配方為試驗中第2組組合，該組合處理下多糖產量為10.8 g·L-1，明顯高于其他各組；且其菌絲球小而緊密，分布均勻。

靈芝液體發酵過程中的主要營養物質包含碳源、氮源、礦物質、維生素等，其中碳源是構成細胞物質的基本元素，為靈芝生長發育產生活性物質提供基本能量[18]。蘆葦秸稈作為一種復合有機物質，不僅為靈芝液體發酵提供生長所需的碳源，也為靈芝液體發酵提供其他所需的營養物質。低轉速培養時，產生的低剪切力會影響發酵液混合以及氧傳遞，導致溶氧量降低，從而使發酵效果降低[19]，影響靈芝多糖的產出；而加入蘆葦秸稈可以使發酵液粘稠、充滿顆粒感，進而使搖瓶中的剪切力、溶氧性大大增加，與基礎培養基相比，菌絲產多糖量顯著提高。除此之外，氮源也是作為靈芝菌絲體生長的必要元素，通過單因素試驗發現，液體培養中對氨源的選擇有較大差異，其中添加硫酸銨作為氮源的是靈芝發酵液及糖含量最高，因此選擇硫酸銨作為靈芝液體發酵的氮源，并通過調節硫酸銨的添加量來篩選最適宜靈芝液體發酵的培養基氮源。

正交試驗方差分析結果見表3。

表3 正交試驗方差分析表Tab.3 Analysis of variance of orthogonal test

如表3所示，蘆葦秸稈添加量對液體培養靈芝的多糖產量無顯著性差異，但硫酸銨添加量和培養基初始pH對多糖產量具有極顯著差異。

2.3 驗證試驗結果分析

對正交試驗篩選出的組合進行驗證，驗證試驗結果見圖8。

圖8 驗證試驗結果對比Fig.8 Comparison of verification test results

如圖8所示，在A1B3C3組合條件下培養的菌絲體胞外多糖含量為10.82 g·L-1，與正交試驗結果相近，誤差不超過2%，具有良好的重現性。驗證結果較優化前的基礎液體培養基比，多糖含量有明顯提高，提高4.41倍。

3 結論與討論

報道的研究中，靈芝液體發酵的碳源、氮源以及pH對靈芝液體發酵胞外多糖的產出均有重要意義。不同pH對靈芝菌絲體的生長發育和多糖產出有不同的影響；驗證試驗結果顯示，pH為8時多糖產量最大，這與劉冬等[15]多糖含量最佳pH為5.6的結果不同；但在基礎培養基初始pH＞5.6時，多糖產量雖微低于pH 8時的產量，但均會趨于一個穩定的數值，出現這種差異可能是由于蘆葦秸稈的理化性質引起。另有報道pH影響多糖的提取，在堿性條件下可更充分地提取多糖[20]。

首次將蘆葦秸稈作為液體發酵液的變化成分，控制其他參數（包括培養溫度、培養時間、接種量等） 不變，以提高胞外多糖產量為目標，通過正交試驗優化靈芝液體發酵液的配方發酵條件，優化靈芝液體發酵工藝。結果表明，在液體培養基中蘆葦秸桿配比為0.3%、硫酸銨配比為1.3%、pH 8、轉速170 r·min-1、溫度27℃的條件下，液體發酵靈芝的胞外多糖產量最高，為10.82 g·L-1；相比基礎培養基優化效果明顯，較優化前提高了4.41倍；且試驗具有較好的重復性。另外，添加蘆葦秸稈發酵出的菌絲體形狀相比基礎培養液發酵出的菌絲體更緊實、細密，利用其作為原種進行栽培后可以正常出芝。該試驗的結果為蘆葦秸稈資源利用及靈芝液體發酵工業化生產提供了理論依據和試驗指導。