“滬農靈芝1號”代料栽培培養基配方優化研究*

陳 群，闞勁松，杜軍華，劉仙明

（1.合肥學院生物食品與環境學院，安徽 合肥 230601；2.青海師范大學生命科學學院，青海 西寧 810008；3.東至縣葛公菌種場，安徽 池州 247240）

靈芝（Ganoderma lingzhi）隸屬于擔子菌門（Ba sidiomycota）靈芝科（Ganodermataceae）靈芝屬（Ganoderma），被《神農本草經》《本草綱目》等中醫名著列為上品之物，在中國傳統文化中被視為吉祥之物，素有瑞草的美譽[1]。靈芝子實體、孢子粉、菌絲體均可入藥，含有多種生物活性成分，如多糖類、核苷類、多肽類、三萜類等，其中多糖和三萜兩大類活性物質被認為是靈芝的主要藥效成分[2]。現代藥理學研究表明，靈芝可以提高機體免疫能力、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、提高機體耐缺氧能力，以及改善睡眠質量、安心養神等，具有廣闊的研究開發前景[3]。

40年來，食（藥）用菌科研工作者緊密圍繞應用最新分子生物學技術為育種服務，解決生產實踐中科學問題等主題開展眾多科學活動[4]，促進食用菌種業的健康發展，更好地滿足食用菌產業高質量可持續發展的需求[5]。“滬農靈芝1號”是上海市農科院食用菌研究所利用遺傳學和現代分子生物學技術培育成功的靈芝品種。其特點為抗病、高產，孢子粉產量高，多糖和三萜含量高。因抗病能力強可較大程度減少農藥使用，確保靈芝子實體和孢子粉質量安全[6-7]。

“滬農靈芝1號”在浙江、安徽有較大栽培面積，但均是椴木栽培。椴木栽培消耗木材資源較多，不符合當今農林產業可持續發展理念。因此開發代料栽培模式，減少木材消耗，充分利用木屑、秸稈、甘蔗渣等農林廢棄物，可實現廢棄物資源化利用，取得社會效益和經濟效益良性平衡。

通過對前期文獻[8-9]及大量實際生產情況調研，研究選取雜木屑為碳源，麩皮、尿素為氮源，以尿素添加、鈣鹽添加量、鎂鹽添加量作為試驗因素，優化“滬農靈芝1號”菌絲代料培養基配方，為“滬農靈芝1號”原種、栽培種、代料栽培的培養基配方提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

“滬農靈芝1號”母種為東至縣葛公菌種場的商品生產種，在東至縣葛公菌種場制作成接種用原種。雜木屑（不含松木）和麩皮由東至縣葛公菌種場采購提供，食品級石膏采購自山東昊啟生物科技有限公司，食品級一水硫酸鎂采購自濰坊圣川化工有限公司。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蒽酮、硫酸、甲醇、冰醋酸、高氯酸、乙酸乙酯、乙醇均為分析純，西隴科學股份有限公司產品；香草醛（純度99%）、齊墩果酸（純度98%），國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器

AE124分析天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司產品；UV7600紫外-可見分光光度計，上海棱光技術有限公司產品；JY92-IIN超聲波處理器，寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-8恒溫水浴鍋，金壇區環宇科學儀器廠產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 響應面試驗優化代料栽培配方

在前期預試驗基礎上，用于調配代料培養料原料物質有：木屑（1 000 g）、麩皮（200 g）、玉米粉（20 g）、白砂糖（15 g）、石膏（25 g）、尿素、過磷酸鈣、硫酸鎂，pH自然，根據試驗處理組尿素、鈣鹽、鎂鹽添加量要求，變動尿素、過磷酸鈣、硫酸鎂添加量以調整試驗組配方。

菌種培養料裝袋量為500 g，設計25 mL接種杯固定接種量，接種于菌種袋一端中心位置。20℃～28℃恒溫無光培養，空氣濕度控制在75%左右，每天上午8:00、下午5:00固定開門窗通風30 min。所有裝袋與接種均在一輪試驗批次完成。根據前期預試驗，結合生產實際，應用Design-Expert軟件中Box-Behnken模塊（Box-Behnken Design，BBD） 設計3因素3水平因素水平表，共產生17次BBD試驗處理組，其中含5次中心點（基準水平）重復試驗，每處理組設置10袋重復，具體配方見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Tab.1 The factor and levels of response surface experiments

記錄接種后菌絲長滿種瓶天數，取（100-實際天數）為響應值R。應用軟件進行多元回歸擬合處理，獲取二次多項式回歸方程，利用方差分析對該模型的顯著性進行分析和評價，利用軟件優化功能獲取最佳參數的預測值。

1.3.2 田間代料栽培試驗

在葛公菌種場山地搭建高2.8 m～3.0 m的棚架，棚架四周用遮陽網圍住。棚架內再搭建高約2.5 m的拱形栽培大棚，拱棚上覆蓋無滴膜，拱棚四周挖排水溝。拱棚下做畦，畦上進行靈芝代料栽培。

栽培前對場地進行清洗消毒，根據生產實際情況和原料成本綜合考慮，并參考響應面試驗結果制定栽培料配方。菌棒裝袋量為1 500 g，設計50 mL接種杯固定接種量，接種于菌種袋一端中心位置，11月底至次年2月制棒接種，4月～6月排場栽培，6月～7月出芝，7月～8月收粉。

在靈芝菌芽開傘前，整畦鋪上接粉地膜。當靈芝生長成熟且菌蓋邊緣完全變成紅褐色時，在每畦插上小拱架，架上覆蓋無紡布，將整個畦罩住以便進行孢子粉收集。靈芝產粉之前采收部分靈芝子實體。子實體與孢子粉烘干、稱重，按2015版《中華人民共和國藥典》方法[10]對孢子粉多糖和三萜含量進行測定。

田間試驗于2019年和2020年共進行2次，同時每次制備少量椴木埋土栽培菌棒作為對照。

2 結果與分析

2.1 Box-Behnken響應面設計優化栽培料配方

響應面試驗優化設計結果見表2。

表2 響應面試驗優化設計結果Tab.2 The optimized results of response surface experiments

對建立的二次方程模型和試驗結果進行方差分析，檢驗該模型的有效程度，結果見表3。

表3 BBD試驗方差分析表Tab.3 The variance analysis of BBD experiments

由表3可知，該模型的F值較大，為64.7，P＜0.000 1，說明相關系數的顯著性，擬合程度較好；失擬F值為3.4，其P＞0.05，說明失擬項不顯著，因此模型在被研究的區域內擬合度比較高，因此該模型可以用于后期的優化處理。在一次項中，尿素比例與鈣鹽比例均達到了極顯著水平（P＜0.01），鎂鹽比例對結果影響不顯著（P＞0.05）；在二因素交互項中，尿素比例與鈣鹽比例、尿素比例與鎂鹽比例間均存在交互作用（P＜0.01）。從以上分析數據還可以得出，單因素對菌絲長滿接種瓶天數影響順序由大到小為：尿素比例（A） >鈣鹽比例（B） >鎂鹽比例（C），交互作用對天數影響順序由大到小為：AC>AB>BC。

經過Design-Expert 8.0軟件進一步對試驗數據進行處理，擬合出了關于A、B、C的二次多項回歸方程：

R=33.60+4.63A+1.75B+0.12C-2.25AB-2.50AC-0.25BC-11.05A2-5.3B2-2.55C2

方程中的正負符號及系數反映了不同因素對于R的影響方向及程度。通過SPSS最優化處理，得出當尿素比例（A） 為0.9%、鈣鹽比例 (B)為2.55%、鎂鹽比例 (C)為0.08%時，菌絲長滿接種瓶的時間為66.4 d。

以本響應面試驗優化出的參數，結合生產實際，結合菌絲形態學特征，設計原種、栽培種培養基配方。

2.2 田間代料栽培試驗

根據生產實際情況和原料成本綜合考慮，并參考響應面試驗結果制定2019年田間代料栽培培養料配方（木屑15 000 kg、豆粕100 kg、麥麩1 000 kg、石膏150 kg、石灰200 kg、硫酸鎂10 kg），裝袋量為1.5 kg，尿素比例1.4%，鈣鹽比例2.1%，鎂鹽比例0.6%。其代料栽培與椴木栽培的子實體與孢子粉的多糖和三萜含量見表4。

表4 2019年田間代料栽培配方子實體與孢子粉多糖、三萜含量測定結果（n=10）Tab.4 The determination results of polysaccharides and triterpenes in fruit body and spore powder of culture media for field substitute cultivation in 2019(n=10)

由表4可知，2019年代料栽培子實體與孢子粉三萜含量均低于椴木栽培，差異顯著，2種栽培模式下，多糖、三萜含量均遠高于藥典標準水平。另外還可發現，無論是代料栽培還是椴木栽培，孢子粉三萜含量均高于子實體，而多糖含量則均低于子實體。因此2020年調整栽培料配方，降低尿素添加至0.84%，鈣鹽、鎂鹽添加比例不變，適當添加葡萄糖與磷肥，其配方調整為木屑15 000 kg、豆粕300 kg、麥麩1 500 kg、石膏150 kg、石灰200 kg、硫酸鎂10 kg、葡萄糖100 kg、磷肥50 kg，其代料栽培與椴木栽培的子實體與孢子粉的多糖和三萜含量見表5。

表5 2020年田間代料栽培配方子實體與孢子粉多糖、三萜含量測定結果（n=10）Tab.5 The determination results of polysaccharides and triterpenes in fruit body and spore powder of culture media for field substitute cultivation in 2020(n=10)

由表5可知，通過上述配方調整，三萜含量有所提高，達到椴木栽培的三萜含量水平。2019年、2020年2年田間試驗產量結果表明，2種栽培模式下，代料子實體與孢子粉產量均高于椴木栽培，代料栽培孢子粉平均棒產35.6 g，產粉后子實體35.2 g，產粉率101%。代料子實體與孢子粉產量均較高，發展代料靈芝栽培，不僅生產寶貴中藥材，還是回收利用碎木屑、蔗渣、秸稈等農林廢棄物的有效途徑，生態環境效益顯著。

3 結論

隨著社會進步和生活水平提高，人們養生健體、治未病的理念越來越強，消費需求也越來越多。靈芝產業健康發展，可滿足人們高水平生活的需要，社會意義重大。開發“滬農靈芝1號”代料規范化標準栽培模式，完善配套靈芝產業鏈和產業技術服務體系，引導合作社與農戶組織代料栽培。充分利用農林廢棄物資源，實現廢棄物資源化利用，減少木材消耗，引領靈芝產業的升級轉型和可持續發展。有助于靈芝產業實現專業化分工、集約化布局、產業化經營的新格局。此舉不僅保護環境，還可帶動合作社、菇農增產增收、農村勞動力就業，實現經濟效益和環境效益雙豐收，進而促進政府鄉村振興工作，助力美麗鄉村建設。