長根菇優良菌株評價與篩選*

王 月，任梓銘，于延申

（吉林省蔬菜花卉科學研究院，吉林 長春 130000）

長根菇[Hymenopellis raphanipes（Berk.）R.H.Petersen]隸屬于擔子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱（Agaricomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 膨瑚菌科（Physalacriaceae） 小奧德蘑屬 （Hymenopellis）[1]，又名長根小奧德蘑、露水雞地從[2]等，俗稱“黑皮雞地從菌”，是新近商業化栽培的熱點食用菌[3]。該菌曾被誤認作長根奧德蘑（Oudemansiella radicata）、鱗柄小奧德蘑 （Oudemansiella furfuracea） 及雞地從菌（Termitomyces albuminosus），Hao等[4]2016年將該菌認定為卵孢小奧德蘑（Oudemansiella raphanipes），分類學研究中將其歸為小奧德蘑屬（Hymenopellis）[5]。

長根菇味道鮮美，營養價值高，具有預防種瘤、抑制幽門螺旋桿菌等作用[6]，子實體中含有的長根菇素（Oudenone）具有一定的降血壓作用[7]，深受消費者喜愛。目前，對長根菇優良菌株篩選的報道較少，因此，從全國范圍內收集了8個長根菇栽培菌株，對菌株進行ITS序列測定并構建系統發育樹，明確其種源信息，排除同物異名現象。通過考察記錄子實體形態和農藝性狀，對長根菇菌株進行評價，同時篩選出適合吉林省栽培、具有品種改良價值的優質菌株，為長根菇育種提供資源儲備。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

8個供試長根菇菌株分別命名為HYA、HYB、HYC、HYE、HYF、HYG、HYH、HYI，其來源詳見表1。

表1 供試菌株來源Tab.1 The source of the tested strains

1.1.2 培養基

母種培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH自然。液體菌種培養基：1 L液體培養基加豆柏粉 7 g、葡萄糖 20 g、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、維生素B112 mg、消泡劑（C2H6OSi乳液）0.2 mL～0.4 mL、輕質碳酸鈣適量，pH調整至約6.5，加水至1 L。栽培種培養基：棉籽殼20%、木屑44%、玉米芯20%、麥麩15%、石灰1%。

1.2 試驗方法

1.2.1 分子生物學鑒定

1） 基因組DNA提取

無菌條件下，刮取PDA平板上的新鮮菌絲作為試驗材料，以DNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取基因組DNA。

式中，yi為實驗結果；n為實驗次數；m為目標值。在某些特例下，鈦合金介觀尺度銑削表面粗糙度傾向于望目特性或望大特性。例如，生物醫用材料表面粗糙度影響細胞黏附，各局部區域表面粗糙度需要控制在一定的范圍內，并非越小越好。除此之外，對于零件表面粗糙度期望往往傾向于更小，符合望小特性。本文的優化目標是使各區域銑削表面粗糙度趨向于更小，各銑削區域表面粗糙度測量結果和信噪比計算結果如表5所示。

2） ITS序列擴增

引物選擇真菌ITS通用引物ITS1和ITS4，PCR反應體系50 μL：2×PCR反應混合物25 μL，引物（0.2 μmol·L-1）各1.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 21 μL。在PCR儀上擴增，程序設定為：94℃預變性3 min；94℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30個循環；循環結束后72℃延伸8 min。

3）ITS序列測定、比對及系統發育樹構建

純化后的PCR擴增產物和引物，由吉林省庫美生物科技有限公司進行測序。測序結果利用BLAST在線比對工具進行比對，使用MEGA 6.0軟件進行系統發育分析，采用Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

1.2.2 拮抗試驗

在滅菌的超凈工作臺上，用母種培養基倒平板，至培養基完全鋪滿整個培養皿，厚度不宜過大，以方便后期試驗觀察。將制備好的培養基平板底部劃分為2塊區域，并隨機組合2個不同編號的菌株，用無菌操作接種技術，將對應編號的菌株接種于相應區域中央，使其相距2 cm～3 cm，做好標記并封口，后將平板置于25℃恒溫培養箱中避光培養，待平板長滿菌絲后，觀察菌株間的拮抗情況。

1.2.3 菌絲生長情況比較

在滅好菌的超凈工作臺中，使用母種培養基倒平板，采用無菌操作打孔接種技術，用7 mm的滅菌打孔器取相同菌齡的供試菌株，接種于培養基平板中央，每組3個重復，做好標記并封口。將接種好的平板置于25℃恒溫培養箱中避光培養，采用“十”字交叉法，每24小時測定菌絲生長速度，觀察菌絲生長情況。菌絲平均生長速度（V，mm·d-1）的計算公式為：

式中：D表示菌落直徑（mm）；d表示培養天數（d）。

按照配方備料，原材料用清水預濕處理12 h～24 h后，將各種原料加水充分攪拌均勻，培養料含水量60%～65%，pH 6.0～7.0。菌袋用17 cm×33 cm×0.03 cm的高密度低壓聚乙烯塑料袋，裝料松緊適度、均勻一致（每袋濕料1.2 kg）。常壓滅菌4 h，當料內溫度達100℃后，保持恒溫15 h～20 h。滅菌后的料袋放入事先用氣霧消毒劑熏蒸好的接種室，待料溫降至30℃以下后，在超凈臺內接種。試驗采用完全隨機區組設計，每個菌株設3個重復，每個重復設長3 m、寬1 m、深20 cm的畦床，畦間留50 cm～60 cm的操作道。將菌袋脫去塑料袋，直立排放在畦內，細土粒填滿空隙，上面覆蓋4 cm～5 cm的土壤。出菇管理參照參考文獻[8]。

1.2.5 測定指標

在長根菇整個生育期，調查菌絲至子實體階段共15個農藝性狀，性狀指標及調查方法參照NY/T 3715-2020植物品種特異性（可區別性）、一致性和穩定性測試指南 長根菇[9]，詳見表2。

表2 供試菌株農藝性狀測定方法Tab.2 Assay methods of agronomic traits of tested strains

1.2.6 數據分析

采用Excel 2010做基本數據記錄和處理，計算每個性狀的變異系數（coefficient of variation，CV），根據所得結果分析各性狀的遺傳差異程度。

2 結果與分析

2.1 分子鑒定結果

測序結果使用BLAST在線比對工具進行序列分析，當與已知序列相似性≥99%時，即可判定為同一物種，8株長根菇的系統發育關系見圖1。

圖1 基于ITS rDNA序列的NJ系統發育樹Fig.1 NJ phylogentic tree based on rDNA ITS sequence

由圖1結果顯示，所測8個樣品均為長根菇。從GenBank數據庫下載Hymenopellis屬多個種的ITS序列，選擇Psathyrella candolleana（Fr.）Maire作為外類群，使用MEGA 6.0軟件進行系統發育分析，采用NJ法構建系統發育樹。供試的8個菌株與下載的Hymenopellis屬序列聚成一類，黃白小脆柄菇（Psathyrella candolleana） 單獨為一個分支，其中HYA、HYB、HYG、HYF、HYC、HYE 6株菌株親緣關系相對較近，與HYH、HYI親緣關系相對較遠，HYA與HYI親緣關系最遠。

2.2 拮抗試驗

將8個菌株兩兩隨機組合，無菌操作打孔接種于平板中，25℃下恒溫暗光培養，觀察菌株拮抗反應，其結果見表3。

表3 供試長根菇菌株拮抗反應結果Tab.3 Antagonistic test results of Hymenopellis raphanipes

由表3結果顯示，28個組合中有15組有拮抗反應，HYI與其余7個菌株均有拮抗反應，HYF、HYG和HYH均與HYC、HYE有拮抗反應，HYE與HYC有拮抗反應，HYC與HYB有拮抗反應。

2.3 菌絲生長情況比較

結合拮抗反應結果和系統發育分析，排除同物異名菌株，選擇HYC、HYE、HYH、HYI進行菌絲生長情況比較和農藝性狀比較試驗，比較不同菌株在PDA培養基上及菌袋中菌絲生長速度，結果見表4。

表4 供試長根菇菌株菌絲生長情況Tab.4 Mycelial growth situation of Hymenopellis raphanipes

由表4可知，不同菌株的菌絲生長速度不同，但在0.05和0.01水平上差異均不顯著。菌絲的濃密程度有差異，其中HYE菌絲長勢最好，且栽培種滿袋時間最短，僅需30 d，HYH菌絲生長速度最慢，滿袋時間需40 d。

2.4 子實體形態特征比較

按照1.2.5調查方法對4株長根菇菌株子實體階段形態特征進行比較，對菌蓋顏色、茸毛密度、菌蓋直徑和厚度、菌柄長度和直徑等性狀進行記錄，結果見表5。

表5 供試長根菇菌株子實體形態特征比較Tab.5 Fruit body morphology of Hymenopellis raphanipes

由表5中數據可知，不同菌株菌柄形狀及顏色差異不大，均為柱狀，深褐色。菌株HYH菌蓋呈中等褐色，HYC、HYE、HYI菌蓋均為深褐色。菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長度、菌柄直徑性狀內存在不同程度的遺傳變異，其中以菌蓋直徑的變異最為廣泛，變異系數范圍為0.08～0.16。

2.5 農藝性狀分析

試驗選擇菌株的農藝性狀分析結果見表6。

表6 供試長根菇菌株農藝性狀比較Tab.6 Agronomic trait of Hymenopellis raphanipes

由表6可知，不同菌株原基出現的時間不同，HYE最早出現原基，為33 d；HYI原基分化最遲，為46 d。HYC、HYE子實體形成最快，僅需3 d，與最慢的HYH菌株相差2 d。HYE單位面積產量最高，HYC次之，HYI單位面積產量最低。HYI平均單菇重最高，HYE次之，HYC平均單菇重最低，由單位面積產量及平均單菇重數據比較可知，二者間無直接相關性。HYE生物學效率最高，可達63.6%，HYC次之，HYI生物學效率最低，僅為37.3%。在數據調查中發現，HYI第三潮菇產量約為第一潮的三分之一，出菇后期菌絲活力明顯減弱。

3 討論

菌絲生長階段，各菌株菌絲生長速度差異不顯著，但HYE菌絲長勢最強，栽培種滿袋時間最短。出菇階段，供試的4株菌株子實體形態差異不大，HYI子實體平均單菇重最大，但出現原基時間最遲，生物學效率最低。HYE最早出現原基，且單位面積產量最高，菌蓋及菌柄緊實度偏硬，易于存儲和運輸，篩選出HYE為優良菌株，可進一步在吉林省推廣栽培。

HYI雖原基出現最遲，單位面積產量最低，但子實體平均單菇重最高，HYC在母種培養基上菌絲長速最快，子實體形成時間最短，但平均單菇重最低。結合系統發育結果，HYI與HYC親緣關系最遠，在今后的育種工作中，可將HYC與HYI菌株作為品種改良的親本，以培育出性狀更加優良的長根菇菌株。