石斛酚對(duì)大鼠急性心肌梗死保護(hù)作用的機(jī)制研究

范 斐

（江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210004）

0 引言

急性心肌梗死（AMI）和隨之而來的心力衰竭是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一［1］。AMI后，減少急性心肌缺血/再灌注損傷（IRI）、挽救存活心肌和限制心肌梗死（MI）范圍的最有效治療方法是及時(shí)使用直接經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PPCI）進(jìn)行心肌再灌注［2］。然而，自相矛盾的是，心肌再灌注過程本身會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡和心肌損傷，可占最終心肌梗死面積的50%［3］。因此，AMI 后的死亡率和發(fā)病率仍然很高，需要新的治療方法來縮小心肌梗死的范圍，防止不利的左室重構(gòu)，以減少心力衰竭的發(fā)生，改善AMI后的臨床結(jié)果。

急性IRI 的炎癥反應(yīng)在決定AMI 大小和隨后的MI后不利的左心室重構(gòu)方面起著關(guān)鍵作用［4］，使其成為改善AMI 患者臨床預(yù)后的潛在治療靶點(diǎn)。急性心肌缺血發(fā)生在AMI 時(shí)，會(huì)引起最初的促炎反應(yīng)［5］，其目的是清除心肌梗死區(qū)的壞死細(xì)胞碎片，而IRI 加劇了這種促炎反應(yīng)，并導(dǎo)致了心肌細(xì)胞死亡和心肌損傷。越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，許多不同的參與者參與了炎癥反應(yīng)，它們被證明與急性心肌缺血的有害影響有關(guān)［6］，使它們成為心臟保護(hù)的重要治療靶點(diǎn)。

石斛酚是一種天然存在于石斛中的1，2-二苯乙烷（聯(lián)芐）。文獻(xiàn)表明，石斛酚具有多種生物活性，如抗癌、抗氧化、抗衰老、抗凝、抗突變、抗痙攣和抗炎［7］。本文通過大鼠AMI模型，觀察石斛酚對(duì)心肌梗死范圍（MIS）、血清磷酸肌酸激酶（CPK）、炎癥因子含量及核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB（NF-κB）的影響，初步探討石斛酚抗AMI的作用機(jī)制，為其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Sigma）；Bio-rad垂直電泳槽和PCR 儀器；水平電泳槽等。石斛酚購自Sigma公司；CPK試劑盒購自建成生物工程研究所；白介素-1β（IL-1β）、IL-6 和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒購自 R&D 公司；抗體 NF-κB 和 3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）購自Cell Signaling公司；抗體組蛋白H1（Histone H1）和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗購自Santa Cruz 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 動(dòng)物

雄性SD大鼠50只，質(zhì)量（200±20）g，購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境1周。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將 SD 大鼠 50 只隨機(jī)分為 5 組，每組 10 只，分別為假手術(shù)組、AMI 組、石斛酚高（60 mg/kg）、中（30 mg/kg）、低（15 mg/kg）給藥組，采用尾靜脈注射給藥，假手術(shù)組和AMI 組給予等量生理鹽水，每天1 次。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法與觀察指標(biāo)

按文獻(xiàn)方法進(jìn)行AMI 造模［8］，假手術(shù)組僅置縫線而不結(jié)扎冠脈。各組分別給藥治療。全程記錄心電圖變化，再灌注2 h 后終止實(shí)驗(yàn)。以戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔麻醉，采用腹主動(dòng)脈插管取血，測(cè)量血清CPK，IL-1β，IL-6，TNF-α等生化指標(biāo)；取血后，分離大鼠心臟，洗凈心腔，去掉心房組織及脂肪等，稱質(zhì)量，將左心室沿冠狀面切為6 片，浸入氯化硝基四氮唑藍(lán)（N-BT）緩沖液中，37 ℃水浴中避光孵育15 min，正常組織染色，缺血組織不染色，用缺血心肌與左心室濕重的比例計(jì)算MIS。同時(shí)，取缺血區(qū)心肌組織（假手術(shù)組取供血區(qū)心肌組織）進(jìn)行后續(xù)的Western Blotting實(shí)驗(yàn)。

1.5 Western Blotting 法測(cè)定大鼠心肌組織中NF-κB蛋白表達(dá)

按照胞漿和核蛋白提取試劑盒方法試提取心肌組織胞漿和核蛋白。胞漿蛋白用于NF-κB 和GAPDH 的蛋白表達(dá)分析，而核蛋白用于NF-κB 和Histone H1的蛋白表達(dá)分析，采用分析軟件（Image J）計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)處理結(jié)果用表示。采用SPSS 進(jìn)行單因素方差分析，組間用LSD 法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析，P<0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 石斛酚對(duì)AMI大鼠MIS及血清CPK活性的影響

模型組與假手術(shù)組相比，MIS及血清CPK活性顯著增加（P<0.001），表明AMI 模型建立成功。石斛酚中、高劑量組均能顯著縮小AMI 大鼠的MIS（P<0.01），而石斛酚低、中、高劑量組均能顯著降低血清CPK（P<0.001）活性（見圖1）。

圖1 石斛酚對(duì)AMI大鼠MIS及血清CPK活性的影響

2.2 石斛酚對(duì)AMI大鼠血清炎癥因子的影響

模型組與假手術(shù)組相比，血清TNF-α，IL-1β和IL-6水平均顯著上升（P<0.001），石斛酚中、高劑量能顯著逆轉(zhuǎn)AMI引起的大鼠血清TNF-α，IL-1β和IL-6水平（P<0.001）（見圖2）。

圖2 石斛酚對(duì)AMI大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響

2.3 石斛酚對(duì)AMI大鼠缺血區(qū)心肌組織NF-κB激活的影響

模型組與假手術(shù)組相比，AMI 大鼠缺血區(qū)心肌組織NF-κB（核蛋白）蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.001）。中（P<0.01）、高劑量（P<0.001）的石斛酚降低了NF-κB（核蛋白）蛋白表達(dá)水平，但是各組之間NF-κB（胞漿蛋白）蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著升高（見圖3）。

圖3 石斛酚對(duì)AMI大鼠缺血區(qū)心肌組織NF-κB蛋白表達(dá)的影響

3 討論

心肌梗死是由于冠心病所致。由于中藥能整體調(diào)節(jié)機(jī)體，并具有作用廣泛、安全性能高的優(yōu)勢(shì)，因此，中藥治療心肌梗死越來越受到重視。

MIS 和心肌特異性酶（如CPK）的存在是評(píng)價(jià)AMI 心臟損害的重要指標(biāo)［9］。CPK 廣泛分布于心肌細(xì)胞胞漿中，大鼠AMI 后CPK 活性明顯升高。本研究表明，石斛酚能縮小AMI 模型大鼠MIS，降低CPK活性，提示石斛酚對(duì)AMI具有心臟保護(hù)作用。

急性心肌缺血發(fā)生在AMI時(shí)，會(huì)引起最初的促炎反應(yīng)，其目的是清除MI 區(qū)的壞死細(xì)胞碎片。PPCI 后心肌再灌注的開始，加劇了這種促炎反應(yīng)，并導(dǎo)致了心肌細(xì)胞死亡和心肌損傷，在促炎和抗炎修復(fù)階段之間的平衡和過渡的紊亂都會(huì)加重急性心肌缺血，并導(dǎo)致MI 后不利的左室重構(gòu)。AMI 后，心臟駐留細(xì)胞和循環(huán)炎性細(xì)胞分泌大量促炎細(xì)胞因子，它們通過介導(dǎo)炎癥細(xì)胞向MI區(qū)的募集，在放大IRI的促炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。介導(dǎo)AMI 后促炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞因子是IL-1β，抑制其的表達(dá)可減少M(fèi)I的大小并防止不良的左室重構(gòu)；IL-6發(fā)揮促炎和抗炎作用，并在IRI后釋放，循環(huán)IL-6水平升高已被證明與急性冠狀動(dòng)脈綜合征有關(guān)［10］；且研究表明壞死的心臟駐留細(xì)胞釋放TNF-α和隨后的NF-κB激活誘導(dǎo)AMI后的促炎反應(yīng)［11］，并且 TNF-α，IL-1β和 IL-6 的激活受NF-κB 的調(diào)節(jié)。本研究顯示，AMI 大鼠血清TNF-α，IL-1β和IL-6水平顯著上升，NF-κB（核蛋白）蛋白表達(dá)水平增加，表明AMI大鼠心肌NF-κB激活，繼而引起炎癥因子釋放。

先前的證據(jù)表明，石斛酚可以抑制NF-κB 的活性，從而降低炎癥介質(zhì)的釋放。此外，在人類肝癌研究中，發(fā)現(xiàn)石斛酚能夠抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，從而改善人類肝癌的進(jìn)展［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，石斛酚降低了AMI 大鼠缺血區(qū)心肌組織NF-κB（核蛋白）蛋白表達(dá)水平，同時(shí)改善了AMI大鼠血清炎癥因子表達(dá)水平，因此，石斛酚可能通過抑制NF-κB 激活改善AMI大鼠心肌組織炎癥病理過程。

綜上所述，石斛酚能夠減小AMI 大鼠的MIS，降低AMI 大鼠血清CPK 活性，對(duì)AMI 大鼠具有保護(hù)作用。可能是通過抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活，進(jìn)而改善了AMI 大鼠炎性反應(yīng)對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，從而改善了心臟功能。