WRKY對糖調控園藝作物冷適應的研究進展

潘英杰 張穎 武杞蔓 李正青

（沈陽師范大學生命科學學院，沈陽 110034）

在低溫時節，由于下雪、寒流侵襲或保溫措施不利，常會引起園藝作物遭受冷害或凍害。尤其重要的番茄、黃瓜等喜溫性蔬菜作物，在我國冬季和早春季節生產中常遭遇低溫傷害，嚴重影響了正常的生長發育，降低了產量和品質，給生產帶來嚴重的損失［1］。據有關數據統計，我國銷售的果蔬約1/3屬于低溫敏感型，物流總量每年因冷害損失近30%。所以抗冷問題是作物生產面臨的一項重要的問題［2］。

植物在低溫脅迫下會啟動體內的主動防御機制，植物細胞產生有利物質或啟動逆境相關基因表達，維持植物細胞結構與功能的完整性。糖類作為安全無毒的天然物質，對于提高作物的抗逆性具有較高的研究價值。在溫度下降過程中，植物細胞內一些大分子物質趨向于水解，細胞內可溶性糖含量增加。植物的糖具有許多功能，既可以提供大量能量、作為生物體的結構物質存在，還可以作為信號分子調控植物源-庫關系和基因表達［3］。研究發現外源施加蔗糖、葡萄糖和海藻糖或褐藻寡糖等糖類可顯著改善植株形態、調控作物抵抗冷脅迫，這其中離不開諸多轉錄因子在相關信號通路參與調控。

植物抵抗低溫脅迫的過程是多個代謝反應的綜合［4］。細胞低溫信號逐級傳遞，響應和保護機制通過各種信號途徑啟動。許多轉錄因子通過參與信號傳遞過程，調控下游基因表達，細胞內代謝過程改變而適應低溫的環境［5］。WRKY類轉錄因子是其中的一類重要轉錄因子，可通過不同的信號轉導途徑參與植物的溫度脅迫應答［6］。目前在幾種植物如白菜、黃瓜中鑒定出存在大量WRKY蛋白，參與植物形態建成、次生代謝過程、蔗糖信號傳導及一些由植物激素介導的信號轉導過程，在生長發育、抗病、非生物脅迫響應等各個方面都起重要調控作用［7］。

本文就糖在冷脅迫響應中的作用機理進行生理生化及信號傳遞、與激素信號互作等分子水平進行綜合闡述，并分析討論WRKY轉錄因子于其中的重要作用，探討了施糖下緩解園藝作物低溫逆境傷害的可能信號途徑及應答機制。

1 糖對園藝作物冷脅迫響應的調控作用

糖類物質具有許多生物學功能。糖可參與植物生長發育等生命活動，在脅迫下可起重要的防護作用［8］。近年來隨著海洋科學研究的不斷發展，分子量低、水溶性好、易吸收的海藻寡糖進入人們視野。海藻寡糖種類豐富，以褐藻寡糖（alginate-derived oligosaccharides，ADOs）、卡拉膠寡糖等為代表，具有多種生物活性，如抑菌［9］、抗氧化［5］、促生長［10］等，其開發與利用有利于海洋資源高值化應用［11］。目前有研究表明基因組的減少促進了假單胞菌生產褐藻寡糖，這為褐藻寡糖的大規模投入生產應用提供了準備條件。以海藻糖、褐藻寡糖等為代表，探究天然抗逆物質對于作物抗冷的機制與應用將具有重要意義。以下歸納分析糖對園藝植物響應冷脅迫的作用如表1。

參Reference獻文考2］［1 sechanism分Molecular m理機子用作的素Horm one激中ts’ response to cold stress 3］［1 8］［14］［15］［16］［17］［1［19］［1］Genes related↑及因 相etabolism in apical buds應ey genes for 43表43 PS genes response 達expression基 響關 因 ↑K S基 因謝基GSTU GSTU代鍵g糖cose m MdTP頂to glu 1、1 and個芽22 M關erin花dT成flow OHRB OHRB JA源與Internal sou H2O2、O rce H2O2，O、N，and N內參JA迫lan le脅冷Variab對otic物orticu lture p ility of應 量變e activity eroxidation peroxidation ofid植↓of sucrose synthase藝性 ↓ulation of osm園活 性elative permeab brane lip在istry酶 活irection ccum em糖↓化 酶ntioxidant enzym↑A性us sugar in h brane lipid p源轉抗Ascorbic acid content抗oids and antioxidant capacity向eutral sucrose invertase activity力↑A em ↓M方↑hlorophyll content iochem能↓R oles of exogeno生Physiology，b糖decomposition 累透化1 外 量 化 蔗 解 性對 ↑ ↓ 積 ↓M氧 ↑C化含 氧 性 分 活相brane of leaves成化↑的 過量生酸中em酶黃Flavon 酶膜d n 合氧 力 質氧脂含表、血 和 與an 合 化質 素 過 能 物 過膜理壞 酮 酸Acid糖性 蔗En zyme activity in the d氧片 綠葉Ch plasma m lorophyll synthesis脂 合 脂片 綠抗葉 膜Membrane lipid peroxidation光Photosynthetic capacity透bstances化滲su膜葉leaves素葉ble 1 R ↑果Fruit coloring and appearance↑tent in pericarp↑↑ 量量oid eight質量↑含含 及Ta 質素苷度品卜色itratable acid寬d quality of le sugars、d dry w觀 量 蘿 花 ↓T、an長an外 含 胡 、 量度of short branch根、 素類 糖 長idth ud mylopectin The leaves turn green↑Solub↑、resh質Quality 色 青 和 總 酸芽 綠↓Internode distance糖質 積 ↑F著素性定頂↑ A變距性 品 面 重實ality花inal b青皮溶 滴枝 粉 片間溶 葉 表 干品qu果Anthocyanin con花Anthocyanin and caroten content可Total soluble sugar and anthocyanin含可短Length，w term淀 葉節可 茶Tea quality根Root surface area and root length鮮外Exogenous糖源sugar A AL種Species果Ap ple物 蘋糖Sucrose蔗莓Strawberry草糖Sucrose蔗莓Blueberry藍葡Glucose糖萄 果Ap ple蘋葡Glucose糖萄 子Eggp lant茄AAL茄Tomato番A 糖AL 海Trehalose藻樹Tea tree茶 米Corn玉海Trehalose糖藻 瓜Cucumber黃境Stress逆 無None冷脅迫Cold stress

1.1 糖對園藝作物生長發育的調節

目前諸多研究表明，施糖明顯改善了作物生長發育過程的品質。如外源5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）處理參與了蘋果品質調節，明顯促進果實著色、提高了果皮花青素含量并改善果實外觀品質［12］；外施蔗糖顯著增加了草莓果實的單果重；在果實發育過程中藍莓可溶性總糖、花色苷含量增加，可滴定酸含量有所降低［14］；外源蔗糖處理藍莓果實發育的關鍵品質顯著改善；外施蔗糖、果糖和等體混合液處理均顯著提高草莓果實的可溶性固形物含量；外施蔗糖和葡萄糖加速了草莓果實成熟、花青素的積累增多［13］。由此可見，外施糖的應用可有效緩解逆境對園藝植物生長發育過程中品質的負面影響，為園藝產品保量保質。外施海藻糖緩解了玉米根系根表面積、根長等生理指標冷脅迫下的傷害；冷脅迫下施用ALA緩解了茶樹葉片品質的傷害。

1.2 糖對園藝作物冷脅迫下生理生化的調節

當植物處于寒冷環境下時，細胞內大量產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基。ROS能作為信號傳遞體直接通過激活相關轉錄因子和蛋白激酶發揮作用。然而另一方面，ROS 不斷積累會使蛋白質、脂類代謝異常，破壞超氧化物歧化酶（superoxide dismutases，SOD）等保護酶系統，有害物質積累增多。嚴重時會引起膜脂過氧化，導致膜結構破壞、膜透性增大，膜內離子大量外泄等。研究表明，外施糖可緩解作物低溫脅迫損傷［20］，這主要體現在抗氧化水平調控以及滲透調節等方面。

1.2.1 糖通過抗氧化水平調控作物冷適應 ROS的積累下會產生丙二醛（malonaldehyde，MDA）和硫代巴比妥酸反應物質（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）等物質。生成的丙二醛與蛋白質聯合，導致蛋白質分子內和分子間交互聯合，形成蛋白質交聯產物；同時，丙二醛可降低細胞膜中不飽和脂肪酸含量，抑制膜的流動性，最終導致膜系統結構破壞，甚至引起細胞死亡［21］。可溶性糖可通過磷酸戊糖氧化途徑參與清除ROS。外源施用低濃度葡萄糖可清除脅迫導致的過量ROS，緩解脅迫損傷。對小麥幼苗施用低濃度的葡萄糖，過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶等抗氧化酶活性增強［22］。ADOs處理可刺激合成 ABA，從而誘導一些參與 ABA 信號通路的抗氧化酶合成基因表達，進而減輕逆境傷害［23］。

1.2.2 糖作為滲透調節劑調控作物冷適應 糖類分子既可清除脅迫下的有毒ROS，還可作為滲透調節物質參與作物抗寒，保護膜結構適應低溫環境。在高等植物中各種可溶性糖，如葡萄糖、蔗糖、果糖、棉子糖和水蘇糖等均具有耐寒作用。糖類物質的積累能夠增加細胞滲透勢，進而增強細胞保水能力。如果聚糖解聚能釋放大量的游離果糖，可作為液泡滲透緩沖劑發揮作用。同樣，海藻糖可穩定蛋白質和膜，低溫脅迫下濃度顯著升高；外施海藻糖可顯著提升作物體內抗氧化系統酶活表達及滲透物質的積累使玉米幼苗抗逆能力提高［19］。龐椿朋等［24］發現外施棉子糖寡糖在植株表型、細胞抗氧化水平和細胞滲透勢調節方面均表現出對番茄低溫脅迫的緩解作用。

1.2.3 糖從其他方面調控作物冷適應 糖對生物膜及生物大分子等生命物質有保護作用，低溫下能降低冰點，提高原生質保護能力，保護蛋白質膠體免于遇冷變性凝聚［25］；還可通過與脂質雙層相互作用穩定膜的結構。如果聚糖可在低溫下抵抗結晶［26］。果聚糖可通過降低脂質凝膠相與液晶相轉化的相變溫度，增強糖與膜的相互作用，結合在膜脂的磷酸基和膽堿基團上，穩定細胞膜結構［27］，對膜起保護作用。海藻糖抑制細胞間形成冰晶，避免引起損傷。在低溫下海藻糖替代水分子與膜磷脂及蛋白質分子表面部分結合，保護膜蛋白質防止變性失活，減少膜損傷；又如棉子糖家族寡糖（raffinose family oligosaeeharides，RFOs）置于膜雙分子層的脂質上，在外界脅迫嚴重時穩定脂質，其高寡體可用來保護脂質體，同時可作為自由基清除劑發揮作用［24］。此外，研究表明褐藻寡糖（ADOs）可響應非生物脅迫，增強黃瓜光合作用、調節生長素和赤霉素含量、C和N同化以及合成具有抗病原性和藥用價值的次生代謝物［28］。

1.3 糖對園藝作物冷脅迫下分子機制的調節

外源糖對作物寒冷環境下的適應性調控具有重要的作用，可通過調節多種生理過程增強冷脅迫耐受性，相關研究表明其以濃度依賴方式調控，可溶性糖濃度的增加可提高植物冷脅迫的耐受性［20］。除生理生化方面的調控作用外，糖還可通過與激素互作等在分子層面參與作物冷脅迫應答反應。

植物激素 ABA 是一類脂溶性的小分子植物激素，可以廣泛調節植物的許多反應，在植物冷脅迫防御反應中起重要作用。近年來研究表明，ABA 信號通路對植物防御、生長發育及代謝產物的生物合成等都具有重要作用，如促進脫落、抑制生長、抑制種子萌發等，因而成為研究的熱點。作為重要的脅迫響應激素，通常情況下 ABA 會在低溫下迅速積累，通過整合多種應激信號調節下游應激反應基因表達［29］。現已證實在多種植物體內存在依賴于ABA的抗冷途徑，這一系列脅迫應答過程離不開內源糖的產生與參與信號轉導調控。糖與ABA等植物激素在調節發育過程和脅迫反應過程中具有復雜的相互作用。如葡萄糖和蔗糖是植物發育過程關鍵信號分子［30］，參與信號傳遞過程［31］。外源施用小分子糖，可能通過參與ABA抗冷途徑的調控進行調節。

在糖和植物激素信號之間復雜的互作關系中，葡萄糖感受器——己糖激酶（hexokinase，HXK）起到核心作用。不同的糖信號激活多個HXK依賴和HXK非依賴的途徑，并通過不同的分子機制調控轉錄、翻譯、蛋白質穩定性和酶活性。在冷脅迫下糖信號轉導中，蔗糖非酵解型蛋白激酶、胞外糖感受器和海藻糖代謝等的作用重要而復雜。蔗糖非酵解型蛋白激酶（sucrose non-fermenting related protein kinase，SnRK）是一類催化蛋白質磷酸化反應的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，一般會使底物蛋白質的羥基磷酸化，廣泛存在于多種植物，在植物抵抗逆境過程中起到重要生理功能，可通過 ABA 誘導、不同離子通道及滲透脅迫等激活，調控作物生長發育與冷適應［32］。

綜上，外源小分子糖通過影響植株對冷脅迫的生理生化響應等來增強植物在冷脅迫下的抗氧化能力、緩解膜損傷以及進行滲透調節，進而提高植株對低溫抗性。在分子層面，糖通過信號傳遞、與激素信號互作等途徑參與抗冷調控。

2 WRKY轉錄因子參與冷脅迫下重要基因表達調控

抗逆機制既多元又復雜，植物WRKY類轉錄因子參與很多信號轉導網絡，可與冷脅迫相關應答信號分子彼此之間相互作用，調控多種植物發育和防御進程［33］。

2.1 植物WRKY轉錄因子的結構特征與分類

WRKY是植物的一個轉錄因子超家族。WRKY轉錄因子N端含有高度保守的WRKYGQK等60個氨基酸殘基組成的WRKY 結構域而命名；C端通常有鋅指結構，可通過結合靶基因啟動子中核心序列為（C/T）TGACC（A/T）的W-box，激活或抑制下游基因的表達。根據WRKY蛋白序列中WRKY保守結構域數目及鋅指結構的特點，WRKY轉錄因子可分為3類，其中I類含有兩個WRKY保守結構域，II類只有一個WRKY結構域，二者均為C2H2型鋅指結構（CX4-5CX22-23HX1H），III類只含有一個WRKY結構域，其鋅指結構為C2HC型（CX7CX23HX1C）［34］。其中最原始的WRKY類型為第I類，最為保守；第III類進化最為活躍。WRKY轉錄因子在植物界中廣泛存在，WRKY蛋白能夠廣泛參與植物基因表達的調控［35］，WRKY基因的表達受多種不同環境條件的誘導，在植物的逆境脅迫應答、植株形態建成和生理代謝等方面都發揮重要作用。

2.2 WRKY對園藝作物生長發育的調節

WRKY可參與調控作物多種生理代謝過程的生長發育。如鴨茅WRKY基因DGE1的表達對于正常的體細胞胚胎發生必不可少［36］；ScWRKY1在馬鈴薯胚胎發育后期受精胚珠中強表達［37］。WRKY44也稱透明種皮基因Glabra 2（transparent testa glabra2，TTG2），參與調節毛狀體和根毛的發育［38］；WRKY蛋白SUSIBA2調控胚乳中淀粉的產生。編碼AtWRKY10的Miniseed3基因在花粉、球形胚和發育中的胚乳中表達較高。可見 WRKY 家族可在寒冷環境下參與調節發育過程和冷脅迫反應過程。

2.3 WRKY家族在冷脅迫下的表達

低溫脅迫下，WRKY轉錄因子可調控靶基因表達，參與調節植物的低溫耐受性［39］。王藝璇等［40］發現番茄有27個WRKY家族成員明顯受低溫誘導。其中SlWRKY2、SlWRKY50等基因的啟動子區域存在CRT/DRE元件（CBFs結合位點），可能參與了CBFs介導的低溫響應途徑。張穎等［41］發現4℃低溫下黃瓜CsWRKY46表達量升高，通過轉基因鑒定功能表明其可能通過ABA依賴的信號通路調控植物抵抗低溫。WRKY轉錄因子在植物響應脅迫過程中發揮重要作用［42］，具體如表2。

參Reference獻文考］43［40，5］44-4［41，［46］［47］［48］er作互能的互ith oth作with賴相-box依可子-teraction w 互因7 55）ith W 32 interaction和28，42 and 5 W-box BI5 interaction w A-dependent signaling pathwAB A 5 participate Ys participate in A轉PK他in BA ays不MA 42中的與ays能子其8、Y2路參功能與；ays；echanism 揮32與KY lays its function錄動RK 通啟號發KY體plex p徑I5信KY途CsWR CsWR AB d A vW的KY可RR pathw↑合F-CO 2、2 and 賴VvWR KY（V 46與 依transcription factors VvWR RKvW t signaling pathw F-CO 7制AY（an力個路E-CB KY KY復-com機K YSlWR CsWR CsWR 46 E-CB用CsWR KY SlWR KY CsWR能化VvWR PK KY ABRK 12通Response m應ICIC氧AB抗Antioxidant capacity ltural crops個與vW MA外號3參3 V作in另信Other 12 V dependenin與orticu能功90 17作Y in various h目uction of（reduction Y62等2、7、9、1、4、數Y23、Y49、8、Y40、3、Y3達RK Cla021 Y5Y3Y3Y5Y3Y29、的11、Y43、RK RK RKKY RK RK 表vW 和RKvWvWvWvWvW KY RK sW RK（strong induction of gene RK PK oderate ind調RK中vW物35、SlW SlWR 69、SlW SlWR 43、SlW 25、C 1、 （m sW 55下56、F Y 55）RK 12、V 49、V 33、V 44、VKY 22、V KY藝園RK 23、C KY KY 9、KY KY表VvWR KY KY KY CsWR KY KY 達KY lW CsWR 06、VKY FvWR 達KY KY表SlWR各of W SlWR SlWR SlWR CsWR SlWR 表59（C VvWR VvWR達VvWR VvWR類Y53上調Y59、 表6、Y35、4、Y46上Y62、在Y41、KY RK Y79等RKRK調VvWP Y24、調RK 3、Y5 la0180下Y1 nction RK調4、Y43、KY Y58、RK Y47、Y31、Y21、達Y16、達因gene expression）sW temperature個RK SlWR 上vWvWvWvWvWvWvW RK RK RK function響sW RK RK PK表ression）RK of gene exp27、F Y基，C達59、S 61、S；12 Identified RK調達0）RK 57 顯KY KY fu 2、21、S KY 24、S lWlWlWlWlWsW expression）50、S 36、C RKnd KY響onse to low 著CsWR 2、28、C vW達表KY應28、V表調KY 08、V KY KY KY 表Y255、V調19、V KY 45、V 26、V KY上RKKY KY 11、V KY KY 41下SlWR KY ber a KY能KY 2 W SlWR 18、C溫SlWR 上個SlWR個lW SlWR功SlWR低Resp KYKY CsWR CsWR CsWR CsWR CsWR FvWR 調下個327（C VvWR VvWR VvWR VvWR VvWR VvWR VvWR VvWP表um ble 2 N 定鑒已Y 14、PK Y 49、PK Y 72、PK Ta病Response to pathogen應響78、SlW 58、SlW 21、SlW 68體KY KY KY KY原SlWP SlWP SlWP SlWP育發th生Grow長2、類數SlWR KY 63、49 I多如SlWR KY KY SlWR 25、KY 32、50、52、59 CsWR KYCsWR K YCsWR K YCsWR K YCsWR 56ClWR KY個目Number數種Species物86茄Tomato番57瓜Cu cumber黃6 2莓Strawberry草5 7瓜Waterm elon西5 9萄Grape葡

3 糖信號通路中WRKY調控園藝作物冷適應

WRKY是重要的逆境響應調控因子，諸多研究表明WRKY的冷脅迫調控存在復雜而緊密的關系網絡，可能受外源糖誘導并協同促進作物冷脅迫下的生長發育。

3.1 WRKY與糖類共同參與脅迫下作物生長發育調控

非生物脅迫會抑制植物生長，冷脅迫會限制細胞分裂等生長過程。然而越來越多研究表明，在逆境下植物會主動放慢自己的生長速度以適應環境，受到脅迫的植物通過相關信號自發抑制生長，確保充足的能源供應以適應逆境環境［49］。因此探究作物生長發育的調控機制對于探究脅迫損傷耐受性具有一定作用。

糖類物質作為信號分子與脅迫通過不同的途徑調節作物生長發育，平衡源和庫的新陳代謝和防御反應，適當施用一定濃度的外源糖對于作物的生長發育具有重要的調節作用。一定濃度的ADO可促進黃瓜幼苗生長，增加黃瓜幼苗株高、莖粗、株幅及鮮重，且不同濃度下促進作用不同［50］。

WRKY可能通過多種信號途徑參與冷脅迫下作物生長發育相關調控。作為許多植物過程的關鍵調控因子，WRKY轉錄因子在植物種子形成、萌發、胚胎發育、組織器官發育、植株衰老、葉片衰老等各個重要生長發育過程中發揮著重要作用。

3.2 WRKY參與調控冷脅迫下糖信號表達

植物體內的糖多是在環境脅迫條件下產生的一種應激產物，其含量因外界環境差異而變化。外源施糖可緩解脅迫下的作物損傷，如外施海藻糖可緩解低溫脅迫對黃瓜幼苗的傷害，增強植株體內抗氧化酶SOD、POD活性，可有效清除活性氧；海藻糖溶液處理緩解番茄鹽脅迫傷害，提高番茄植株生長，減輕了鹽脅迫誘導的膜脂過氧化損傷［51］。

研究發現WRKY與糖代謝相關，外源施用糖可能通過WRKY轉錄因子介導脅迫響應調控。WRKY 轉錄因子可參與調控碳水化合物（淀粉）的生物合成代謝［52］，在大麥中克隆獲得的轉錄因子SUSIBA2，按其結構特征歸屬于 WRKY 轉錄因子，能結合糖響應元件（sugar responsive，SURE）的W-box 位點。VvWRKY22在調節糖代謝方面發揮作用，其表達受外源蔗糖抑制、由果糖誘導；過表達VvWRKY22降低了葡萄糖分含量，并調節了葡萄中糖相關基因的表達［53］。糖處理可能誘導WRKY基因響應脅迫，如董蘊琦等發現，嘧肽寡糖處理誘導了WRKY53、WRKY70等基因顯著上調，誘導作物產生抗病性［54］。這也表明了外源糖處理可能通過WRKY基因的調控共同參與抵御寒冷脅迫。Huang等［55］發現糖和ABA處理下的VvWRKYs響應，共表達網絡分析發現似乎聚集在一個模塊中的VvWRKYs、糖和ABA相關基因，預測了VvWRKYs在葡萄生長發育過程中的潛在功能，表明VvWRKYs參與糖和ABA信號途徑。WRKY轉錄因子可能通過ABA信號網絡介導糖信號表達，這或許對糖的低溫響應調控相關，因而外源糖作用下可能通過刺激相關基因表達調控網絡以便作物抵抗低溫傷害。

4 展望

外源施用糖可以緩解低溫脅迫損傷，在生產中有增強蔬菜作物抵抗低溫能力，以實現作物越冬安全及抗污染、提高作物的品質與產量等將發揮重要作用。目前，施糖在農業生產中的應用還未廣泛展開，缺乏統一使用標準與濃度，針對不同作物、不同寒冷環境仍需要進行系統的研究，這有利于糖在園藝作物生產實踐中更加廣泛、有效的利用。

雖然對冷脅迫下植物體內糖響應工作已有展開并取得了相關規律性的結論，但相關研究還主要停留在生理水平上，分子機理的揭示略顯不足，主要集中在一些轉錄因子及功能基因對植物的調節作用研究，轉錄因子的靶基因及整體的調控網絡模式等并不清楚。目前有研究糖濃度水平對于作物抗冷的積極響應，糖感機制模型下WRKY轉錄因子似乎在調控過程中起重要作用，從分子水平上揭示冷脅迫誘導植物糖響應相關基因表達等方面有待進一步深入研究。從激素信號的產生、體內轉導到植物發生相應的生理生化變化，通過了解調控植物生長發育的信號路徑，相關WRKY信號和轉錄調控網絡有待建全完善，以探明糖調節作物冷適應途徑。為指導改良作物抗低溫奠定理論基礎，具有重要的科學和指導實踐意義。