基于大腸埃希菌 O157∶H7的熒光定量凍干檢測試劑盒的研制

粟元 朱龍佼 曹繼娟 劉建龍 許文濤

（1. 中國農業大學營養與健康系 食品精準營養與質量控制教育部重點實驗室，北京 100083；2. 大連民族大學，大連 116600；3. 河北伊萊莎生物技術有限公司，涿州 072750）

食品安全問題是對公眾健康的重大威脅，微生物污染是導致食源性疾病最主要的因素，食源性疾病給全球醫療、經濟和糧食帶來巨大負擔［1］。大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli），于1885年被德國科學家Theodor Escherich發現，又叫大腸埃希菌、大腸桿菌［2］。根據致病作用，大腸埃希菌主要分為8個種類，即能致胃腸道感染的腸道致病性的、腸道產毒素性的、腸道侵襲性的、腸道出血性的、腸集聚性的的大腸埃希菌以及近年來發現的腸產志賀樣毒素同時具有一定侵襲力的大腸埃希菌、致使尿道感染的尿道致病性的大腸埃希菌，以及最新命名的腸道集聚性的黏附大腸埃希菌［3］。大腸埃希菌的毒力因子可以分為4大類，黏附素、腸毒素、強毒力島、致病性腸細胞脫落位點毒力島［2-3］。

大腸埃希菌O157∶H7（E. coli O157∶H7）屬于腸道出血性大腸埃希菌，其毒力基因主要分為3類，溶血素、志賀毒素（包括志賀毒素1、志賀毒素2）和對上皮細胞的粘附素，進一步，溶血素由hlyA和eaeA基因編碼；志賀毒素1、2分別由stx1、stx2編碼，這4個基因也是常用于實現檢測的基因。

針對大腸埃希菌的檢測方法主要分為三大類，傳統檢測方法、免疫學檢測方法和分子生物學檢測方法，這些方法雖應用廣泛［4］，但都存在一些限制。大腸埃希菌的傳統檢測方法（GB 4789.36-2016）的特點是需要耗時增菌培養、分離、生化鑒定，且需要專業人員操作，受到專業環境限制。免疫學方法［5-6］是依賴于抗原和抗體之間的特定組合，其種類多樣，可分為酶聯免疫吸附技術、免疫熒光技術、免疫印跡技術、免疫磁珠分離技術、酶聯熒光免疫分析技術、免疫層析技術。免疫學方法雖檢測效率高、特異性強、實現了免提取、免培養的目標，但成本較高，也需要特定環境進行操作。分子生物學技術［7］的發展，給大腸埃希菌的檢測提供了更多可供選擇的方法，主要分為變溫擴增技術［8］、恒溫擴增技術［9］和生物傳感器［10-11］等。其中，1993 年發展起來的實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）技術應用廣泛［12］，根據熒光信號基團的不同，qPCR可以分為染料法和探針法。針對TaqMan探針，其5′端標記熒光報告基團，3′端標記熒光淬滅基團［51］，當熒光基團和淬滅基團相互靠近時，阻止了熒光基團發出熒光；當引物延伸至寡核苷酸結合位置時，Taq酶可以將其切割成小片段，使報告基團和淬滅基團分開并發出熒光［12］。

真空冷凍干燥技術，簡稱凍干技術，其原理是將溶液凝固后，在真空狀態下將凝固的溶劑升華，再由解吸干燥除去剩余水分的技術，一般分為3個階段，即預凍、升華、干燥［13］。其具有諸多優點，一是低溫低氧不易損傷變性、二是凍干過程中保持原有結構、三是重量輕且易于儲存和運輸、四是復水后基本保持原有性狀。凍干技術也具有不容忽視的劣勢，其會使檢測試劑組分形成冰晶，對其造成嚴重損傷，會加速樣品水分流失，從而降低生物活性［14-15］。因此，為了盡可能減小冷凍干燥過程對檢測試劑組分的損傷，延長保藏期，選擇合適的保護劑至關重要。凍干保護劑是指樣品在凍干過程能夠對樣品進行保護，使其免受損傷的物質，其種類多樣，按照化學結構可分為6類，即糖類、氨基酸類、鹽類、聚合物類、糖脂類和多元醇類，其功能也有所不同［16-18］，如表1所示。

表1 凍干保護劑的分類Table 1 Classification of the lyoprotectant［16］

目前，部分公司開發了部分E. coli O157∶H7的qPCR檢測試劑盒，如廣東華銀醫藥科技有限公司、北京百奧萊博科技有限公司、上海康朗生物科技有限公司、江蘇科晶生物科技有限公司等，但未進行凍干，市場上存在小部分E. coli O157∶H7的熒光定量凍干檢測試劑盒，國產的如廣州華峰生物科技有限公司（八連排凍干），進口的如賽默飛世爾科技（96孔板凍干），兩家凍干試劑中均含有特異性引物和探針，總體而言，市場上缺少本研究6種食源性致病菌的熒光定量凍干檢測試劑盒，對于第三方檢測機構和許多企業等，這成為迫切的需要。

本文結合qPCR技術和凍干技術，研制了一種既實現精準定量，也便于儲存運輸的快速檢測試劑盒，用于簡單、靈敏、特異鑒定E. coli O157∶H7。首先，該技術針對大腸埃希菌的eaeA基因設計引物，該設計包括一條正向引物、一條反向引物和一條熒光探針，熒光探針分別修飾FAM熒光基團和TAMRA淬滅基團；其次，通過4種成分組成的復合凍干保護劑和qPCR體系混合凍干后組裝成熒光定量凍干檢測試劑盒，克服了常用商品化擴增試劑盒需冷藏運輸和冷凍儲存的缺點，節約了冷鏈運輸的成本，且減少了加樣過程中的氣溶膠污染。所提出的方法可在45 min內檢測到2.1 copies/μL的E. coli O157∶H7，其檢測效果優，靈敏度高，且特異性強。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究涉及的DNA序列在上海生工生物技術有限公司（生工生物，中國上海）合成；E. coli O157∶H7 BNCC192101、鼠傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌、單核增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌由中國農業大學農業部轉基因生物安全評價（食品）重點實驗室提供；超純水是從Millipore MilliXQ系統（美國貝德福德）獲得的，用于溶解引物等；rTaq酶、PCR緩沖液（10×）、dNTPs（10 mmol/L）是從TaKaRa（中國北京）購買的。細菌基因組DNA提取試劑盒是從天根（中國北京）生化科技有限公司購買的；PerfectStartTMIIProbe qPCR SuperMix是從北京全式金生物技術有限公司購買的；月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯是從青島高科技工業園海博生物技術有限公司購買的。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養E. coli O157∶H7的培養 將50 μL E. coli O157∶H7、大腸埃希菌ATCC 25922、腸集聚性大腸埃希CICC 24186、腸產毒性大腸埃希菌CICC 10667、腸侵襲性大腸埃希菌CICC 10662加入LST液體培養基中，在（36±1）℃下以200 r/min的速度搖晃，時間為18 h-24 h。阪崎腸桿菌的培養：按照國標（GB4789.40-2016）增菌步驟進行培養。

1.2.2 基因組提取 按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟進行操作。提取完基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定完整性。具體方法：在 5 μL 樣品中加入 1 μL 6×Loading buffer，在2%瓊脂糖凝膠上進行點樣，電泳儀的電壓為 120 V，電泳時間為30 min。

1.2.3 基因組驗證及模板量測定 提取DNA后，利用兩條細菌16S rDNA引物對提取的E. coli O157∶H7的基因組進行PCR擴增，16S rDNA 引物如表2所示，PCR反應體系總體積為25 μL：0.5 μmol/L F1和R1，1×PCR反應緩沖液，0.8 mmol/L dNTPs，0.06 U rTaq DNA聚合酶和DNA。反應體系在95℃下預變性5 min，然后在95℃下變性10 s，在55℃下退火30 s，在72℃下延伸10 s，經過35個循環。測定基因組濃度，并根據以下拷貝數計算公式計算拷貝數：（6.02×1023copies/mol）×（濃度g/mL）/（MW g/mol）。

1.2.4 引物設計 E. coli O157∶H7的特異性引物設計是根據NCBI數據庫中的大腸埃希菌eaeA基因序列（GenBank 登錄號 U38618.1），使用 Primer 5.0 軟件 和 Integrated DNA Technologies（IDT） 設 計 PCR反應的引物及探針（表2）。

表2 qPCR引物序列Table 2 Primers’ sequences of qPCR

1.2.5 qPCR體系的建立及優化 初步建立的qPCR擴增體系如下：20 μL反應體系：PerfectStartTMII Probe qPCR SuperMix（2×），1× ；E. coli O157∶H7-F（10 μmol/L），0.3 μmol/L ；E. coli O157∶H7-R（10 μmol/L），0.3 μmol/L ；E. coli O157∶H7-P（10 μmol/L），0.3 μmol/L ；DNA 模 板，1 μL ；ROX（50×），1× ；ddH2O，6.8 μL。qPCR 系統運行體系（ABI Step One Plus）：95℃，5 min；循環開始，95℃，10 s；60℃，30 s；72℃，30 s，共40個循環，每40 s記錄一次熒光信號。陰性對照：阪崎腸桿菌DNA代替模板DNA，其它反應條件不變。空白對照：RNase-free水代替模板DNA，其它反應條件不變；在初步建立的體系基礎上，優化引物F、R 的濃度。濃度分別為：0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.6 μmol/L、0.8 μmol/L 和 1.2 μmol/L ；接著，優化引物與探針的比例，其比例分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。即E. coli O157∶H7的探針的濃度分別為 0.13 μmol/L、0.2 μmol/L、0.4μmol/L、0.8 μmol/L、1.2 μmol/L。各實驗組3個平行，qPCR系統運行體系（ABI Step One Plus）：95℃，5 min；循環開始，95℃，10 s；60℃，30 s；72℃，30 s共40個循環，每40 s記錄一次熒光信號，測定熒光曲線，并通過2%瓊脂糖凝膠進行電泳；最后，優化退火溫度，分別為50、53、56、59、62、65℃。qPCR系統運行體系（ABI Step One Plus）：95℃，5 min；循環開始，95℃，10 s；50、53、56、59、62、65℃，30 s；72℃，30 s， 共40個循環，每40 s記錄一次熒光信號，測定熒光曲線，并通過2%瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.2.6 qPCR體系的靈敏度及特異性分析 分別對E. coli O157∶H7基因組連續進行10倍梯度稀釋，以稀釋后的基因組作為模板，稀釋至8個不同的濃度水平，即 2.1×108copies/μL、2.1×107copies/μL、2.1×106copies/μL、2.1×105copies/μL、2.1×104copies/μL、2.1×103copies/μL、2.1×102copies/μL、2.1×101copies/μL，在各自最優的反應條件下，分別進行qPCR擴增。用RNase-free水代替模板，設立空白對照。針對E. coli O157∶H7，提取大腸埃希菌ATCC 25922、腸集聚性大腸埃希CICC 24186、腸產毒性大腸埃希菌CICC 10667、腸侵襲性大腸埃希菌CICC 10662的基因組，分別作為qPCR擴增的模板，按照最優體系進行擴增，驗證qPCR擴增體系的特異性，每種靶標3個平行，用RNase-free水代替模板，設立空白對照。

1.2.7 凍干保護劑對qPCR擴增的影響 通過前期預實驗，選取4種常用的凍干保護劑，分別是海藻糖、PBS、BSA和甘露醇。基于qPCR最優擴增體系，研究海藻糖、PBS、BSA、甘露醇對qPCR擴增的影響。其他反應條件不變，海藻糖在20 μL qPCR擴增反應體系中的終濃度（質量體積分數）分別為1.5%、3.5%、5.5%、7.5%、9.5%；PBS分別為0.1×、0.2×、0.3×、0.4×、0.5×；BSA分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%；甘露醇分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，從而優化出海藻糖、PBS、BSA和甘露醇不會對qPCR產生抑制作用的最優濃度C1。

1.2.8 凍干保護劑保護作用濃度的確定 基于1.2.7的結果，研究海藻糖、PBS、BSA和甘露醇的凍干保護作用。其他反應條件不變，海藻糖在20 μL qPCR擴增反應體系中的終濃度分別為4.5%、5.5%、6.5%、7.5%、8.5%；PBS分別為0.2×、0.3×、0.4×、0.5×、0.6×；BSA分別為0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%；甘露醇分別為0.15%、0.25%、0.35%、0.45%、0.55%，從而優化出海藻糖、PBS、BSA和甘露醇的最優凍干保護作用質量濃度C2。

1.2.9 熒光定量凍干檢測試劑盒的建立 通過試劑盒檢測E. coli O157∶H7，添加19 μL水將qPCR擴增混合凍干樣品加復水，向各 PCR 管中加入1 μL靶標DNA，同時設立未凍干擴增試劑和未添加凍干保護劑的凍干擴增試劑為對照，進行qPCR擴增，反應結束后，觀察qPCR擴增曲線的平滑度、Ct值、熒光強度。

1.2.10 熒光定量凍干檢測試劑盒的穩定性 將熒光定量凍干檢測試劑盒置于常溫儲存15 d、1個月、2個月，定期取試劑盒進行qPCR擴增，考察不同時間儲存后的檢測性能，同時設立未凍干樣品為陰性對照，反應結束后，觀察qPCR擴增曲線的平滑度、Ct值、熒光強度。

1.2.11 熒光定量凍干檢測試劑盒的重復性 研究批內變異系數的方法是在同一時間研制3個熒光定量凍干檢測試劑盒置于常溫儲存，取試劑盒進行qPCR擴增，每個試劑盒3個平行；研究批間變異系的方法是在不同時間分別研制3個熒光定量凍干檢測試劑盒置于常溫儲存，取試劑盒進行qPCR擴增，每個試劑盒3個平行，反應結束后，觀察qPCR擴增曲線的平滑度、Ct值、熒光強度。

1.2.12 實際樣品的檢測 選購超市市售冷鮮牛肉1份、冷鮮豬肉1份、冷鮮雞肉1份樣品，無菌稱取25 g放入盛有225 mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質杯做成1∶10、1∶1 00、1∶1 000樣品勻液。分別取上述3種稀釋度樣液1 mL接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯，置（36±1）℃ 恒溫箱內培養48 h。接著，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟進行DNA提取，最后利用所研制的E. coli O157∶H7熒光定量凍干檢測試劑盒對其進行檢測。同時，用接種環取48 h后的培養液分別劃線接種于伊紅美藍平板，（36±1）℃培養 18 h-24 h。

2 結果

2.1 基因組的提取及驗證

如圖1-A所示，提取的E. coli O157∶H7的基因組通過2%瓊脂糖凝膠進行電泳，獲得完整的DNA，提取的DNA條帶亮，說明濃度合格；沒有拖尾嚴重的現象，說明長度沒有斷裂；無雜帶，說明沒有RNA污染。如圖1-B所示，用兩條細菌16S rDNA引物對E. coli O157∶H7基因組進行PCR擴增，獲得90 bp的目的條帶，且無其他雜條帶。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis image

2.2 qPCR體系的優化

2.2.1 引物F、R的濃度優化 圖2是引物F、R的濃度優化結果，如圖所示，隨著引物F、R濃度增高，Ct值沒有一定的規律（圖2-C），熒光強度逐漸增大（圖2-A）。當引物F、R濃度為0.2 μmol/L時，Ct值最小，但熒光強度最低，當引物F、R濃度為0.4 μmol/L時，Ct值增加少，且熒光強度明顯提升，當引物F、R濃度大于0.4 μmol/L后，Ct值逐漸增大，且擴增曲線不是很平滑。電泳圖（圖2-B）中，當引物F、R濃度在0.4 μmol/L后，擴增條帶亮度無明顯變化，當引物F、R濃度為1.0 μmol/L時，陰性對照和空白對照出現了假陽性。因此，定量圖與電泳圖結果一致，但qPCR比傳統電泳圖更加靈敏。綜合考慮，引物F、R最適濃度為0.4 μmol/L。

圖2 大腸埃希菌O157∶H7引物 F、R 的濃度優化Fig. 2 Concentration optimization of F and R of E. coli O157：H7

2.2.2 引物與探針的比例優化 圖3是引物與探針的比例優化結果，如圖所示，當引物與探針的比例逐漸減小，Ct值逐漸減小（圖3-C），當引物與探針的比例小于3∶1后，熒光強度逐漸增強，當引物與探針的比例為1∶3時，Ct值最小，但擴增曲線不平滑，出現了嚴重曲折，且重復性不佳，當引物與探針的比例為1∶1時，Ct值較小，且熒光強度高。電泳圖（圖3-B）中，引物與探針的比例為1∶1時，條帶最亮，當引物與探針的比例為1∶2和1∶3時，陰性對照和空白對照出現了假陽性。因此，定量圖與電泳圖結果一致，但qPCR比傳統電泳圖更加靈敏。綜合考慮，引物與探針的最適比例為1∶1，即探針的最適濃度為0.4 μmol/L。

圖3 大腸埃希菌O157∶H7的引物與探針的比例優化Fig. 3 Optimization of the ratios of primers to probes of E.coli O157∶H7

2.2.3 退火溫度的優化 圖4是退火溫度的優化結果，如圖所示，當退火溫度逐漸增大時，熒光強度逐漸減弱（圖4-A），當退火溫度為50℃時，Ct值最小（圖4-C），但曲線不平滑，當退火溫度為53℃時，Ct值較50℃時相差不大，當退火溫度大于59℃時，抑制了擴增，圖4-B中，條帶無明顯變化。因此，定量圖與電泳圖結果一致，但qPCR比傳統電泳圖更加靈敏。綜合考慮，最適退火溫度為53℃。

圖4 大腸埃希菌O157∶H7的退火溫度優化Fig. 4 Optimization of annealing temperature for E. coli O157∶H7

2.3 靈敏度和特異性

根據實驗得到的最優反應體系和反應條件，進行qPCR檢測方法的靈敏度分析。圖5是E. coli O157∶H7的靈敏度分析結果，如圖所示，Ct值隨著大腸埃希菌濃度的減小而逐漸增大，且在2.1×108- 2.1×102copies/μL的濃度范圍內呈良好線性關系，其回歸方程為Y = -3.194 8 lgX+41.766（R2= 0.995 9），其檢測限為2.1 copies/μL。因此，說明建立的qPCR檢測方法具有較低的檢測限和較寬的檢測范圍，呈現較高的靈敏度。

圖5 建立的大腸埃希菌O157：H7檢測方法的靈敏度Fig. 5 Sensitivity of the established E. coli O157：H7 detection method

根據實驗得到的最優反應體系和反應條件，進行qPCR檢測方法的特異性分析。圖6是大腸埃希菌的特異性分析結果，如圖所示，E. coli O157∶H7擴增曲線的Ct值明顯小于其他菌種，且擴增曲線平滑、熒光強度最強，而其余菌種擴增曲線拐點已不清楚或沒有擴增，說明構建qPCR檢測方法對大腸埃希菌檢測具有較好的特異性。

2.4 凍干保護劑對qPCR擴增的影響

圖7-A、B是海藻糖對E. coli O157∶H7 qPCR擴增的影響，當最終質量濃度為5.5%時，Ct值最小，且擴增曲線熒光強度最強，當最終質量濃度為其余值時，Ct值增大，擴增曲線熒光強度減弱，重復性差。圖7-C、D是PBS對E. coli O157∶H7 qPCR擴增的影響，當最終質量濃度為0.2×時，Ct值最小，當最終質量濃度為0.1×時，Ct值增大，當最終質量濃度大于0.3×后，Ct值增大，擴增曲線熒光強度減弱或完全抑制了擴增。圖7-E、F是BSA對E.coli O157∶H7 qPCR擴增的影響，當最終質量濃度為0.6%時，Ct值最小。當最終質量濃度為其余值時，Ct增大，擴增曲線熒光減弱或重復性不佳。圖7-G、H是甘露醇對E. coli O157∶H7 qPCR擴增的影響，如圖所示，甘露醇對擴增的影響很明顯，當最終質量濃度為0.2%時，Ct值最小，擴增曲線熒光強度最強，當最終質量濃度為其余值時，擴增曲線拐點已不清楚且熒光減弱

圖7 凍干保護劑對 qPCR 擴增的影響Fig. 7 Effect of lyoprotectant on qPCR amplification

2.5 凍干保護劑保護作用濃度的確定

圖8-A、B是海藻糖的凍干保護作用結果，當最終質量濃度為4.5%、5.5%、8.5%時，Ct值相當，擴增曲線熒光強度4.5%和5.5%較強，當最終質量濃度為其余值時，Ct值增大，擴增曲線熒光強度減弱或擴增曲線拐點已不清楚。圖8-C、D是PBS的凍干保護作用結果，當最終質量濃度為0.2×時，Ct值最小，擴增曲線熒光強度最強，當最終質量濃度為0.3×時，Ct值增大，當最終質量濃度為其余值時，擴增曲線拐點已不清楚或完全抑制擴增。圖8-E、F是BSA的凍干保護作用結果，當最終質量濃度為0.6%、0.9%時，Ct值和擴增曲線熒光強度相當，當最終質量濃度其余值時，擴增曲線熒光強度減弱或拐點已不清楚。圖8-G、H是甘露醇的凍干保護作用結果，如圖所示，當最終質量濃度為0.25%時，Ct值最小，擴增曲線熒光強度最強，當最終質量濃度為其余值時，擴增曲線拐點已不清楚且熒光強度減弱。

圖8 凍干保護劑對 qPCR 體系的凍干保護作用Fig. 8 Freeze-drying protective effect of lyoprotectant on qPCR system

2.6 熒光定量凍干檢測試劑盒的建立

基于此，凍干保護劑由5.5%海藻糖、0.2×PBS、0.6%BSA、0.25%甘露醇組成，并與qPCR體系組成試劑盒。圖9-A是利用試劑盒檢測E. coli O157∶H7的擴增曲線圖，如圖所示，當通過試劑盒檢測時，實驗組Ct值較小、有平緩的擴增曲線、擴增曲線熒光強度較強，與未凍干擴增試劑對照組的擴增曲線幾乎重合，而未添加凍干保護劑的凍干擴增試劑的Ct值較大或擴增曲線拐點已不清楚或無擴增曲線，圖9-B是由海藻糖、PBS、BSA、甘露醇組成的復合凍干保護劑與qPCR體系混合凍干后的形態，1是無凍干保護劑凍干的樣品，其幾乎沒有形狀，2是無甘露醇的復合凍干保護劑體系凍干的樣品，其呈透明狀，在反應管上有粘附。3是試劑盒中的樣品，其呈白色海綿狀，有效物質較為緊密，管壁上沒有粘附。

圖9 熒光定量凍干檢測試劑盒的建立Fig. 9 Establishment of the fluorescent quantitative lyophilized detection kit

2.7 熒光定量凍干檢測試劑盒的重復性

圖10-A是利用同一時間研制的3個E. coli O157∶H7熒光定量凍干檢測試劑盒檢測E. coli O157∶H7的檢測效果，每個試劑盒分別3個平行，如圖所示，熒光曲線幾乎重合，3個熒光定量凍干檢測試劑盒的Ct平均值分別為17.596、17.917、17.937，批內變異系數分別為0.26%、0.51%、0.3%；圖10-B利用不同時間研制的3個熒光定量凍干檢測試劑盒檢測E. coli O157∶H7的檢測效果，如圖所示，熒光曲線幾乎重合，3個熒光定量凍干檢測試劑盒的Ct平均值分別為17.85、17.63、17.957，批間變異系數分別為0.39%、0.49%、0.093%。

圖10 熒光定量凍干檢測試劑盒的重復性Fig. 10 Reproducibility of the fluorescence quantitative lyophilized detection kit

2.8 熒光定量凍干檢測試劑盒的穩定性

圖11是E. coli O157∶H7熒光定量凍干檢測試劑盒在常溫下放置2個月、4個月、半年后的檢測效果，如圖所示，放置3個時間段的試劑盒的擴增曲線幾乎重合，因此，熒光定量凍干檢測試劑盒穩定性高，儲存期長。特別注意，由于空氣中含有水分等可能影響凍干試劑保存效果的成分，為了使其復溶后能夠達到使用目的，同時為了防止凍干試劑的形態因吸水而塌陷，使用前需要將其進行密封保存，儲存環境須滿足干燥、清潔、不易受到外界污染等條件。

圖11 熒光定量凍干檢測試劑盒的檢測效果Fig. 11 Detection effect of the fluorescence quantitative lyophilized detection kit

2.9 實際樣品的檢測

利用所研制的E. coli O157∶H7熒光定量凍干檢測試劑盒分別對生牛肉、生豬肉和生雞肉進行檢測，如圖12-A所示，擴增曲線無明顯Ct值。同時，利用國標法進行對比，如圖12-B所示，伊紅美藍平板上無黑色中心典型菌落，兩種方法都表明3種實際樣品均未檢測出E. coli O157∶H7。

圖12 實際樣品的檢測Fig. 12 Detection of actual samples

3 討論

大腸埃希菌種分類較多，毒素不同，毒力因子不同，對應菌株分析特異性基因是擴增成功的決定性因素。隨著qPCR技術的不斷發展，國內外已有許多研究報道了針對大腸埃希菌的qPCR方法，靶標菌的特異性基因不盡相同。針對大腸埃希菌，常用的靶基因主要有rfbE、eaeA、stx1、stx2、uidA等［19-21］。qPCR體系反應條件優化對于擴增是必要的，引物濃度、引物與探針的比例、退火溫度對避免擴增曲線熒光強度弱、避免引物二聚體、避免低靈敏度具有決定性作用。引物濃度低影響擴增曲線熒光強度，引物濃度過高影響特異性［7］，探針濃度高影響擴增曲線平滑度和擴增特異性，退火溫度過高或導致模板和引物結合不牢固，過低則容易產生非特異性擴增。Ibekwe等［8］所建立的qPCR檢測方法其檢測限為3.5×103CFU/mL；王建昌等［22］所建立的qPCR檢測方法其檢測限為103CFU/mL；柯振華等［23］采用多重實時熒光PCR技術檢測靶標致病菌，對于E.coli O157∶H7的檢測限為103CFU/mL。

對于凍干保護劑體系，首先要考慮到qPCR擴增是微體系擴增，加入的組分可能對擴增會有影響，因此，凍干保護劑首先要滿足不對擴增產生任何抑制作用的要求，每種凍干保護劑的濃度對擴增曲線熒光強度和Ct值具有較大的影響，有的還影響擴增曲線的平滑度。另外，在凍干過程中主要發揮保護作用，每種凍干保護劑的最適濃度對凍干和擴增都很重要［16，24］。凍干保護劑種類較多，其化學結構不同，實現的功能也不同，海藻糖作為穩定劑，是目前應用最廣泛的糖類保護劑，磷酸鹽作為緩沖劑，BSA具有較高的玻璃化轉變溫度，甘露醇作為填充劑，復合保護劑能夠更全面地對qPCR擴增試劑進行保護，且能夠保持理想的外觀，其是凍干試劑包裝、運輸和儲存的基本要求［25］。在凍干過程中，預凍是不可忽視的，應注意要避光凍干，凍干機上方應用黑色的避光材料遮擋。儲存試劑盒時，也應注意避光。對于凍干保護劑影響擴增曲線熒光強度和Ct值的機制［13，16］，目前尚不清楚，需要在后續研究中進一步探討。

我們所構建的熒光定量凍干檢測試劑盒便于常溫儲存、常溫運輸，其檢測限可低至2.1 copies/μL，并且在特異性檢測中，也體現了良好的選擇性。因此，實驗結果證明該檢測方法在對E.coli O157∶H7檢測時體現了較高的靈敏度和特異性，體現了本檢測方法的可靠性。

4 結論

本文研制了一種針對E.coli O157∶H7的熒光定量凍干檢測試劑盒。本研究所提出的方法具有以下兩個優勢：（1）靈敏度高特異性強。對E.coli O157∶H7的eaeA基因進行特異性引物設計，建立了qPCR最優擴增體系，其檢測靈敏度高，檢測限為2.1 copies/μL，且特異性強。（2）試劑盒便于常溫儲存及運輸。