白蟻菌圃中木質素降解菌的篩選及降解效果

韓東晶 王志花 周寧 劉國慶 楊少華 汪文君

（合肥工業大學食品與生物工程學院，合肥 230601）

木質素是自然界中最豐富的可再生能源之一［1］，也是自然界中最大的芳香劑儲備原料。與纖維素、半纖維素共同組成木質纖維素，在植物細胞壁中，木質素填充了纖維素與半纖維素之間的空間，并將木質纖維素緊緊的包裹在一起［2］。其結構主要是通過3個單木質醇的自由基聚合過程而形成的，單體之間自由基偶聯導致形成大量的單元鍵合，這些單元間的連接主要包括醚鍵和碳碳鍵等，具有復雜性和異質性［3］。由于木質素這種復雜的結構，使得對纖維素和半纖維素的酶解產生可發酵糖及高附加值產品的開發形成了一定的阻礙，所以木質素能否有效的去除也影響著纖維素和半纖維素的有效利用［4］。對木質素的處理通常有物理法、化學法和生物法［5］等，物理法主要是通過機械等物理方式破壞木質素的顆粒大小及結構進一步提高后續處理效果，化學法則是通過酸堿等試劑破壞木質素單體之間的化學鍵使之分解，從而達到去除木質素的目的。但是物理法與化學法存在成本高、對環境不友好、回收困難等缺點，而生物法清潔高效、反應能耗低，從而引起研究者的廣泛關注。生物處理主要借助于自然界中的細菌或真菌，真菌具有產生多種氧化還原酶的能力［6］，在木質素解聚方面起到了重要的作用，而有的研究發現細菌在衍生自木質素的異質低分子量化合物的礦化中起主要作用［7］，如紅球菌、假單胞菌、鞘氨醇等能夠通過分泌過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶來降解木質素［8-10］。與真菌相比細菌降解木質素的能力較弱，但更快的生長速度和更寬的環境耐受性的特征使其可以大規模培育和生產，在木質素降解方面具有很大的應用潛力［11］。

本研究從廢棄的白蟻菌圃中篩選出一株能夠固氮并具有木質素降解能力的細菌，經16S rRNA測序，結合形態觀察結果，命名為R.ornithinolytica RS-1；以堿木質素為底物進一步探究了該菌株在降解木質素過程中相關酶活的變化以及降解效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 供試白蟻菌圃購于廣東省茂名化州市。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 LB培養基 胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，瓊脂22 g，加蒸餾水配成1 000 mL，pH 7.2，121℃滅菌20 min，液體培養基不加瓊脂。

1.1.2.2 Ashby無氮培養基 甘露醇10 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.2g，CaCO35 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.1.2.3 堿木質素培養基 （NH4）2SO42 g，MgSO40.5 g，K2HPO41 g，NaCl 0.5 g，堿性木質素5 g，瓊脂粉22 g，H2O 1 L，121℃滅菌20 min，液體培養基不加瓊脂。

1.1.2.4 苯胺藍培養基 胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉22 g，苯胺藍0.4 g，H2O 1 L，121℃滅菌 20 min。

1.1.2.5 愈創木酚培養基 胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉22 g，0.4%愈創木酚，H2O 1 L，121℃滅菌20 min。

1.1.3 試驗儀器 高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；智能恒溫振蕩器，天津歐諾儀器股份有限公司；無菌操作臺，蘇州凈化設備有限公司；恒溫培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；紫外分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；冷場掃描電鏡，日立公司；傅里葉紅外光譜儀，美國賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 取1 g的白蟻菌圃置于49 mL的無菌水中，于28℃、180 r/min的搖床震蕩3-4 h，之后離心過濾取上清得到菌懸液。取1 mL的菌懸液于9 mL的無菌水中得到10-1的菌懸液，按同樣步驟依次操作得到10-7、10-8、10-9濃度梯度。每個梯度取200 μL涂布于LB固體培養基上，28℃下觀察菌株生長，之后再將單個菌落進行平板劃線直至得到純菌株。將得到的菌株畫線于無氮培養基上，觀察其是否可以在無氮源的情況下進行生長。

將實驗所篩選出來的菌種送至上海生工進行16S rRNA測序，將測序完成的16S rRNA基因序列拼接后，提交至NCBI網站的GenBank數據庫，并進行Blast同源性相似度對比，下載Blast比對序列同源性較高的菌株序列，利用MEGA6.0軟件計算序列相似度，同時用Neighbor-joining法構建菌株系統發育樹，確定物種的系統發育地位。

1.2.2 木質素降解酶活性的定性檢測 采用苯胺藍脫色平板進行過氧化物酶的測定，愈創木酚顯色平板進行漆酶的測定。將篩選出來的菌株在無菌操作條件下用接種環挑取一定量分別在兩種染料培養基上進行劃線，置于28℃恒溫培養箱中培養，每天觀察，以苯胺藍培養基中菌落周圍是否產生脫色圈判定是否有過氧化物酶的產生，以愈創木酚培養基中菌落周圍是否有顯色圈判定是否有漆酶的產生。

1.2.3 木質素降解酶的定量測定 從LB固體培養基上切取一塊大小為0.5 mm2×0.5 mm2的菌塊接種于LB液體培養基，28℃，180 r/min搖床培養2-3 d，之后接種于堿木質素液體培養基中，接種量為2%，進行為期一周的降解實驗，每個酶活進行3組平行測定。粗酶液的制備：取10 mL堿木質素液體培養基于8 000 r/min離心10 min，得上清液即為粗酶液。

1.2.3.1 過氧化物酶的測定 過氧化物酶的測定時運用藜蘆醇測定法［12］，在試管中加入2.7 mL酒石酸-酒石酸鈉緩沖液（250 mmol/L，pH 4.5）和0.1 mL 10 mmol/L藜蘆醇溶液后，再0.1 mL的粗酶液，在28℃下加入20 mmol/L過氧化氫溶液啟動整個反應。反應2 min后于310 nm波長處測定吸光度OD值。在上述實驗條件下進行酶促反應，一個活力單位（U/mL）為每分鐘產生1.0 μmol藜蘆醇。計算公式如下：

ΔA：時間t內吸光值的變化量；V1：反應體系的總體積；V2：加入樣品的體積；V：參與反應粗酶液的體積（mL）；N：粗酶液的稀釋倍數；m：浸提每克干曲酶所用緩沖液體積（mL/g干曲）；t：反應時間；ε：摩爾消光系數，ε310=9.3×103mol-1·cm-1。

①以“氵”(同“水”)為形符的字：江、河、湖、海、潑、灑、洶、涌、汁、湯；這些字都跟水有關，“江、河、湖、海”表示不同的水域，“潑、灑、洶、涌”表示水的運動狀態，“汁、湯”表示與水有關的液體。

1.2.3.2 錳過氧化物酶活力的測定［13］在試管中加入3.4 mL乳酸-乳酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 5.0）和0.1 mL 0.4 mol/L MnSO4溶液后，再準確加入稀釋的待測粗酶液0.4 mL，在28℃下加入0.1 mL 3.2 mmol/L過氧化氫溶液啟動整個反應。反應3 min后于240 nm波長處測定吸光度OD值。在上述實驗條件下進行酶促反應，一個酶活力單位（U/mL）為每分鐘產生 1.0 μmol Mn3+。ε240=6.5×103mol-1·cm-1。

1.2.3.3 漆酶活力的測定［14］在試管中加入2.7 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（50 mmol/L，pH 5.0）和0.2 mL 1.0 mmol/L ABTS溶液后，再準確加入待測粗酶液0.1 mL，在28℃下加入0.1 mL 20 mmol/L過氧化氫溶液啟動整個反應。反應2 min后于430 nm波長下測定吸光度OD值。在上述實驗條件下進行酶促反應，一個酶活力單位（U/mL）為每分鐘產生1.0 μmol ABTS。ε430=3.6×104mol-1·cm-1。

1.2.4 細菌對木質素降解率的測定 用普魯士法［15］測定木質素降解過程中的濃度變化情況，進行3組平行測定。

1.2.4.1 木質素濃度標準曲線圖的繪制 取若干根試管進行編號，分別取1.5 mL不同濃度（10-40 μg/mL）堿木質素加入到試管中，再依次加入100 μL的 8 mmol/L K3Fe（CN）6和 100 μL的 0.1 mol/L 的FeCl3到試管中，混勻后在30℃的搖床中反應5-10 min。在700 nm波長下測量吸光度，以去離子水作為空白對照。以木質素濃度（μg/mL）為橫坐標，對應的OD值為縱坐標，繪制木質素濃度標準曲線（圖 1）。

圖1 木質素濃度標準曲線Fig. 1 Lignin concentration standard curve

1.2.4.2 木質素濃度的測定及降解率的計算 液體堿木質素培養基稀釋一定的倍數后，按上述方法測定其吸光度，將OD值代入到木質素濃度標準曲線中，計算木質素濃度及降解率。公式中A0為初始的木質素濃度，A1為某時刻培養基中剩余的木質素濃度。

1.2.5 掃描電鏡表面結構分析 取未接菌處理0 d與接菌處理7 d后的堿木質素培養基，于8 000 r/min離心10 min，棄上清，將沉淀物用冷凍干燥機進行干燥后，噴金進行掃描電鏡觀察。

2 結果

2.1 木質素降解菌的分離純化與鑒定

2.1.1 木質素降解菌的分離純化 待培養基上長出菌落時，挑取單菌落進行多次劃線分離后，將單菌落接種于LB固體培養基，挑取菌落較大和生長速度較快的菌株在無氮培養基上進行培養、觀察。發現菌株RS-1能夠生長，菌落光滑透明，呈圓形有輕微凸起（圖2-A）。采用苯胺藍和愈創木酚培養基觀察其脫色和顯色能力，將菌株接種于染料培養基過夜培養后，發現菌株RS-1能夠使苯胺藍培養基產生明顯的透明圈（圖2-B），同時也觀察到菌株RS-1在愈創木酚培養基上沒有產生明顯的顯色圈（圖2-C）。但是僅通過染料脫色只能簡單的判斷產酶的特性，并不能具體的了解酶的活性大小，所以還需后續實驗加以驗證。

圖2 菌株RS-1在不同培養基上生長情況Fig. 2 Growth of strain RS-1 on different media

2.1.2 木質素降解菌分子生物學鑒定及生長特性 將篩選出來的菌株送至上海生物工程公司進行16S rRNA測序，結果顯示菌株RS-1序列數為1 478 bp，將序列進行Blast同源性對比，與解鳥氨酸拉烏爾菌有99%的相似度。觀察其形態，兩頭圓形呈短桿狀（圖3-A），結合發育樹（圖4），將RS-1菌株暫時命名為R.ornithinolytica RS-1。菌體（包括死菌與活菌）密度用OD600表示，其生長曲線變化趨勢如圖3-B所示，培養至第2天時菌體生長達到穩定期。

圖3 菌株RS-1掃描電鏡觀察圖（A）及生長曲線圖（B）Fig. 3 Scanning electron microscopic observation（A）and growth curve（B）of strain RS-1

圖4 菌株RS-1系統發育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of strain RS-1

2.2 木質素降解菌降解堿木質素過程分析

2.2.1 木質素降解相關酶活的測定 為了解細菌RS-1降解木質素的情況，對堿木質素液體培養基木質素酶活進行測定。由圖5可以看出，在3種酶中錳過氧化物酶的活性最強，其次是過氧化物酶和漆酶，在為期7 d的培養過程中3種酶的酶活都是呈現出先增大后減小的趨勢。在前3 d錳過氧化物酶最大值為1 466.67 U/L，過氧化物酶最大值為177.42 U/L，漆酶的最大值為6.94 U/L。

圖5 木質素降解過程中相關酶活隨時間變化情況Fig. 5 Variation of relevant enzyme activity over time during lignin degradation

2.2.2 木質素降解率的測定 用普魯士法進行了木質素濃度的測定，了解細菌在培養過程中降解木質素的效果。未接菌0 d處理的堿木質素濃度經測定為23.606 μg/mL，經過接菌處理的堿木質素隨著降解時間的延長，木質素濃度發生了變化，前3 d下降趨勢明顯，在第3天的時候達到17.89 μg/mL，此時木質素的降解率達到24.21%，之后木質素濃度及降解率變化緩慢（圖6）。

圖6 木質素濃度以及降解率隨時間變化情況Fig. 6 Lignin concentration and degradation rate over time

2.3 木質素降解菌降解特性分析

2.3.1 木質素表面結構分析 為觀察堿木質素在降解過程中的變化，取未接種0 d處理與接菌處理7 d的堿木質素，進行掃描電鏡觀察（放大倍數為500倍）。如圖7所示，圖7-A為未處理的堿木質素表面結構，整體呈現為凹凸不平的塊狀結構，相對緊密；圖7-B是經細菌處理7 d后的堿木質素，呈現無規則分散的狀態且表面疏松多孔，與未處理組的相比顆粒直徑明顯減小，有的顆粒直徑小于100 μm，說明堿木質素經處理后表面結構受到了很大程度的破壞，該菌對木質素的降解有一定的效果。

圖7 堿木質素處理前后掃描電鏡圖Fig. 7 Scanning electron micrographs before and after alkaline lignin treatment

2.3.2 傅里葉紅外光譜分析 通過掃描電鏡只能觀察堿木質素表面結構的變化，并不能說明堿木質素內部的變化，所以通過傅里葉紅外光譜對處理與未處理的樣品進行測定，觀察其相應官能團的變化情況。如圖8所示，處理與未處理組的譜圖有明顯的變化主要集中在1 800 cm-1-800 cm-1指紋區，1 602 cm-1、1 510 cm-1、1 425 cm-1處的吸收峰歸于木質素組分中芳香族骨架的伸縮振動，1 462 cm-1處的吸收峰歸于C-H的變形振動和苯環的伸縮振動，木質素中的紫丁香基型（S）單元和愈創木基型（G）單元分別在1 331 cm-1、1 251 cm-1處有伸縮振動，833 cm-1處的吸收峰歸于紫丁香基型（S）單元中C2和C6的平面C-H及對羥基苯基丙烷（H）單元的所在位置的伸縮振動。細菌處理過后的堿木質素在1 034 cm-1、1 060 cm-1、1 118 cm-1、1 182 cm-1、1 300 cm-1、1 425 cm-1、1 478 cm-1、1 538 cm-1處吸收峰減小，這幾處與堿木質素側鏈，C=O、C-O和芳香環骨架有關，說明木質素結構受到了破壞。

圖8 堿木質素處理前后紅外譜圖變化情況Fig. 8 Variations in FIR spectra untreated and treated alkaline lignin treatment

3 討論

木質素在植物中的作用是增加細胞壁的完整性和抵御病原體的侵襲，保護了內部的纖維素和半纖維素結構［16］。現階段有許多研究對纖維素和半纖維素的降解比較關注，因為水解時產生可發酵的糖作為生產生物乙醇及乳酸等的原料，但是對這兩種物質進行有效降解時，還得對木質素進行去除［17］。由于木質素復雜的結構，尋求一種有效的降解方法是如今面臨的一個問題。張鵬飛等［18］從高溫堆肥中篩選出木質素降解酶活力較高的菌株，鑒定為嗜熱嗜脂肪地衣芽孢桿菌。崔家榮等［19］采用檸條作為單一碳源的篩選培養基、苯胺藍篩選培養基從牲畜糞便以及檸條腐質中分離篩選出對檸條木質素具有降解作用的菌株D-11，經鑒定為地衣芽孢桿菌，在最優條件下對檸條木質素降解率為18.21%。王晶等［20］從腐木中篩選分離到一株木質素降解菌株CCZU-WJ6，通過形態學觀察和16S rDNA序列分析，鑒定該菌株屬于無色桿菌屬（Achromobacter sp.），通過單因素實驗進行條件優化，使木質素的降解率達到了32.1%。以上實驗結果表明，自然界中有許多具有木質素降解能力的細菌還有待被挖掘。

木質素降解實驗中發現細菌RS-1能夠分泌3種木質素降解酶，且酶活大小依次為錳過氧化物酶＞過氧化物酶＞漆酶，但木質素結構復雜，其降解酶系不能僅通過這3種酶來評價，后期實驗應通過其他手段如蛋白組學去探究其他的木質素降解酶。李峰［21］從白蟻腸道進行木質素降解菌的篩選，經鑒定為解鳥氨酸拉烏爾菌屬，與本實驗不同的是這株菌在以堿木質素為碳源生長過程中沒有檢測到錳過氧化物酶活力，只檢測到漆酶和木質素過氧化物酶活力。在第4天木質素過氧化物酶的活力達到最高為105.6 U/L，漆酶在第3天活力達到最高為32 U/L。可能是因為菌種來源地不同，雖然是同一菌屬，但是培養條件等各不相同也影響了相關酶的活性，具體差異性還應當通過其他先進的技術手段進行分析。

白蟻及白蟻菌圃作為一個復雜的微生物體系，其中含有各種各樣的細菌和真菌，之前的研究主要是真菌，尤其是白腐真菌［22-25］，挖掘高效木質素降解菌，探索其木質素降解特性和降解機制是研究的熱門，近些年來，由于細菌的獨特優勢，對于細菌的研究慢慢的成為了一個新的方向［26-28］。實驗從廢棄白蟻巢中篩選出來的解鳥氨酸拉烏爾菌屬細菌，在環境中廣泛存在，具有很強的污染物降解能力［29］。通過掃描電鏡對處理前后的堿木質素表征結構進行觀察，發現細菌處理后有明顯的變化，李峰等［30］從白蟻腸道篩選出來的木質素降解菌進行降解實驗后，通過掃描電鏡觀察其表面也是呈現出粗糙和較多的孔隙。在官能團上，處理與未處理的堿木質素特征峰大都主要集中于1 800cm-1-800cm-1的指紋區，處理后的特征峰峰強減弱或位置發生了偏移，說明與木質素相關的官能團結構遭到了破壞。從以上結果表明細菌在降解木質素方面具有很大的應用潛力，本實驗從廢棄白蟻菌圃中篩選出的細菌為降解木質素提供了一條有效的途徑。

4 結論

本實驗從廢棄白蟻菌圃中篩選出一株菌株R.ornithinolytica RS-1，該菌具有一定的固氮能力，并能夠有效降解木質素。