多發性骨髓瘤中循環骨髓瘤細胞水平及臨床意義

王中良，邢鵬濤，王金慧，劉蒙蒙

多發性骨髓瘤是一種常見的血液系統惡性腫瘤，占所有血液系統惡性腫瘤的10%，其特征為骨髓內克隆漿細胞的異常擴增[1-2]。多發性骨髓瘤的細胞遺傳學異常提示其為一種異質性疾病，對其進行風險評估和個體化治療在改善療效中起關鍵作用[3]。檢測骨髓瘤細胞可直接評估患者的病情，但需抽取患者骨髓，存在樣本獲取過程復雜、創傷大、骨髓液容易被稀釋和患者依從性較差等缺點[4]。文獻[5-6]顯示，多發性骨髓瘤患者外周血中可以檢測到循環骨髓瘤細胞(CMCs)，且對患者預后具有重要的預測價值。而目前CMCs水平是否可以反映多發性骨髓瘤患者的病情并對分期進行預測的研究還較少。本研究收集2017年1月～2020年5月在我院接受治療的72例多發性骨髓瘤患者資料，分析CMCs水平與多發性骨髓瘤疾病進展指標的相關性，并通過ROC曲線檢測CMCs水平預測多發性骨髓瘤分期的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料納入標準：① 符合“中國多發性骨髓瘤診治指南(2020年修訂)”[7]；② 初次診斷為多發性骨髓瘤；③ 未經過相關治療。排除標準：① 合并其他系統惡性腫瘤；② 合并其他血液系統疾病；③ 伴肝、腎等重要器官功能衰竭；④ 合并嚴重感染。本研究納入72例，男41例，女31例，年齡51～73(62.8±9.4)歲。根據流式細胞儀檢測多發性骨髓瘤微小殘留病灶定義的標準，將外周血中CMCs占單核細胞比值≥1×10-4定義為陽性(CMCs陽性組，40例)，<1×10-4定義為陰性(CMCs陰性組，32例)。收集的臨床資料：年齡,性別,多發性骨髓瘤的DS分期、ISS分期以及免疫學分類，全自動生化分析儀檢測患者外周血中血紅蛋白(Hb)、白蛋白(ALB)、Ca2+、尿肌酐(Cr)、乳酸脫氫酶(LDH)和β2微球蛋白(β2MG)水平。所有患者及家屬對本研究知情，并簽署知情同意書。

1.2 外周血中CMCs檢測收集患者治療前的外周血5 ml，通過Ficoll梯度分離外周血樣品中的單核細胞，然后加入CD19、CD38、CD45、CD138和熒光標記的Kappa、Lambda游離輕鏈的抗體[8]。將單核細胞數調整至(5～10)×109/L，使用流式細胞儀(型號：FACS CANTO Ⅱ，BD公司)檢測外周血中CMCs(細胞表面CD19-、CD38+、CD45-、CD138+表達)數量，所得結果采用萬分比表示。

1.3 免疫組化法檢測骨髓組織中Ki67表達情況留取患者入院時初次骨髓穿刺+活檢骨髓組織，置于裝有福爾馬林固定液的容器中，送至病理科進行固定、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，最終制成石蠟標本。切成3～5 μm的薄片，放置恒溫箱(55～60 ℃)中烘烤2 h，取出后室溫下冷卻。梯度乙醇和去離子水浸泡，進行脫蠟和水化，沖洗后放置于清水中待用。經過抗原修復液處理，滴加一抗，放置恒溫箱(37 ℃)中60 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，每次2 min。滴加二抗，在室溫下靜置20 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，每次2 min。滴加適量二氨基聯苯胺顯色劑，室溫下靜置15 min，用清水沖洗。蘇木精染液再次染色30 s，鹽酸水化，自來水沖洗后進行脫水、透明、封片，最終在顯微鏡下觀察Ki67的表達情況，Ki67定位于細胞核內，細胞核為棕褐色則表明Ki67表達為陽性，見圖1。

圖1 多發性骨髓瘤中Ki67的陽性表達(箭頭所示) SP×1 000

2 結果

2.1 兩組一般資料比較見表1。兩組年齡、性別、免疫學分類、ALB、Ca2+和LDH比較差異均無統計學意義(P>0.05)，DS分期、ISS分期、Hb、Cr和β2MG兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 兩組一般資料比較[例(%)]

2.2 Ki67在多發性骨髓瘤中的表達情況Ki67陽性細胞比例：CMCs陽性組為5.3%～40.7%(20.6%±12.5%)，顯著高于CMCs陰性組的0.5%～6.3%(2.8%±2.0%)，兩組比較差異有統計學意義(t=7.972，P<0.001)。

2.3 CMCs與疾病進展指標間的相關性分析見圖2。經過Pearson相關性分析，CMCs與ALB、Ca2+和LDH水平之間無相關性，與Hb水平呈負相關(r=-0.714，P<0.001)，與Cr水平呈正相關(r=0.693，P<0.001)，與β2MG水平呈正相關(r=0.765，P<0.001)，與Ki67陽性細胞比例呈正相關(r=0.756，P<0.001)。

圖2 CMCs與疾病進展指標間的相關性分析

2.4 CMCs對多發性骨髓瘤DS分期Ⅲ期、ISS分期Ⅲ期的評估見圖3和表2。根據ROC曲線特征，CMCs對DS分期Ⅲ期、ISS分期Ⅲ期均有一定的預測價值。

表2 CMCs評估DS分期Ⅲ期、ISS分期Ⅲ期的ROC曲線特征

圖3 CMCs評估DS分期Ⅲ期、ISS分期Ⅲ期的ROC曲線

3 討論

多發性骨髓瘤的診斷主要基于骨髓中漿細胞數量、溶骨性骨破壞情況、貧血、高鈣血癥和慢性腎功能不全等指標[9]。及時了解疾病進展和危險分層對治療方案的選擇和患者預后均有一定幫助，但骨髓抽取難度大，患者依從性低。本研究通過收集多發性骨髓瘤患者外周血，檢測CMCs與多發性骨髓瘤疾病進展指標的相關性，并分析對多發性骨髓瘤患者分期的預測價值。

有研究[10]顯示，β2MG在多發性骨髓瘤中可反映腫瘤的負荷情況，并且是患者預后的重要指標。Hb可以反映貧血程度，Cr反映腎功能損傷程度。本研究結果顯示，CMCs陽性組與陰性組DS分期、ISS分期、Hb、Cr和β2MG比較差異均有統計學意義，說明外周血中CMCs水平與多發性骨髓瘤患者的臨床分期、貧血程度及腎損傷程度具有一致性。經過Pearson相關性分析，CMCs水平與Hb水平呈負相關，與Cr和β2MG水平呈正相關。

Ki67是一種核蛋白，在G1、S、G2期和有絲分裂的細胞核中呈陽性表達[11]，且其表達狀況代表細胞的增殖狀態，可作為癌癥的預后標志物[12-13]。本研究中，CMCs陽性組骨髓中Ki67陽性細胞數明顯高于CMCs陰性組，說明CMCs陽性組中腫瘤細胞增殖較多。經過Pearson相關性分析顯示，CMCs陽性細胞數與Ki67陽性細胞數呈正相關，因此外周血中CMCs陽性細胞數水平可間接反映多發性骨髓瘤患者骨髓中腫瘤細胞的增殖情況。Wang et al[14]研究顯示，免疫磁珠聯合流式細胞術可提高外周血中循環腫瘤細胞(CTCs)的檢測效率，用于監測多發性骨髓瘤患者的微小殘留病變和復發情況。多發性骨髓瘤患者血液中存在循環漿細胞被認為是高度增生性疾病的標志，Granell et al[15]通過細胞學評估存在5%～20%的循環漿細胞與較差的總體存活率有關，且不受年齡、肌酐等因素的影響。Garcés et al[5]研究顯示，CTCs的基因表達與骨髓瘤細胞的基因表達高度相似，僅有55個基因表達存在差異，CTCs過度表達與炎癥、缺氧和上皮-間充質轉化有關，CTCs的過度表達與患者的低生存率有關。另外CTCs的檢測在其他腫瘤中的應用也較為廣泛，對肺癌的早期診斷和預后判斷均具有重要價值。Ilie et al[16]研究顯示，慢性阻塞性肺疾病中有5例患者外周血中檢測到CTCs，而胸部CT卻未發現肺部結節，在隨后的1～4年隨訪中相繼發現肺部結節，并診斷為Ia期肺癌。CTCs的計數和表型可以輔助判斷腫瘤的性質及惡性程度，CTCs計數越多其臨床分期可能就越晚，這在一定程度上可指導臨床決策[17-19]。本研究顯示，CMCs對DS分期Ⅲ期、ISS分期Ⅲ期均有一定預測價值。

綜上所述，CMCs與Hb呈負相關、與Cr、β2MG和Ki67陽性細胞比例呈正相關，對DS分期Ⅲ期和ISS分期Ⅲ期均有一定的預測價值，建議監測多發性骨髓瘤患者檢測外周血中CMCs水平及時了解疾病進展情況。