茅臺酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質的檢測及溯源

胡光源，陳宗校，楊理章，李永素，王和玉，王 莉*

（1.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 遵義 564501；2.中國貴州茅臺酒廠（集團）有限責任公司，貴州 遵義 564501）

酒糟是糧食用于釀酒后殘留的固態混合物，是白酒行業最主要的副產物。除水分外，酒糟中含有豐富的淀粉、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸和微量元素[1]，具有潛在的研究和應用價值。然而目前酒糟的處理和應用主要集中于提取蛋白質、動物飼料、丟糟酒、調味品、纖維素、食用菌培養基、乙醇燃料等的粗加工[2]及生產有機肥[3]等方面，關于酒糟中化學成分及其生物學功能的研究報道較少，通過對酒糟中生物活性物質的發掘和研究，可提高酒糟的二次利用價值，實現利潤最大化。

生育酚和生育三烯酚統稱VE，是人體必需的脂溶性維生素[4-5]。VE是一種強有效的抗氧化劑，具有提高機體免疫力、延緩衰老、神經保護、抑制膽固醇合成及腫瘤細胞生長、預防動脈硬化和心腦血管疾病等多種生理功能[6-7]。甾醇是一類以環戊烷多氫菲為骨架[8-9]，與膽固醇結構相似，類似于維生素原性質的活性物質[10]，目前研究發現，甾醇具有降低膽固醇[11-12]、抗菌[8]、抗炎[11,13]、鎮痛[11]、抗癌[14]、抗腫瘤[15]、免疫調節[16]、抗氧化[17-18]、預防心血管疾病[19]、抑制乳腺增生[20]等多種生物學功能；三萜類化合物是一類基本母核由30個碳原子組成的萜類化合物，是一類重要的中藥化學成分，這類化合物具有溶血[21]、抗病毒[22]、降低膽固醇[23]、神經保護[24]等活性。這3類活性物質均在醫藥、食品、化妝品、化工、紡織等行業有廣闊的應用前景。

本研究擬建立超聲輔助提取結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法分析酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類生物活性物質的方法，在茅臺酒糟中發現生育酚類、甾醇類和三萜類物質共18種，可為酒糟中生物活性物質的高效利用和開發奠定基礎，同時也為酒糟的高附加值利用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茅臺酒糟、茅臺大曲，茅臺酒用高粱和小麥，均由貴州茅臺酒股份有限公司提供。

α-生育酚（純度95.5%）、γ-生育酚（純度≥96%）、麥角甾醇（純度≥95%）、豆甾醇（純度95%）、羊毛甾醇（純度≥93%） 美國Sigma公司；膽甾烷醇（純度≥98%） 美國Alfa Aesar公司；菜油甾醇（純度≥99%） 百靈威科技有限公司；正丁醇、乙醚（均為分析純），丙酮（色譜純）國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙醇、二氯甲烷、正己烷（均為色譜純） 美國Tedia公司；乙腈、乙酸乙酯（均為色譜純） 德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

7890A/5975C GC-MS聯用儀、HP-5毛細管色譜柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；Mikro 220R型離心機 德國Hettich公司；8800超聲波清洗機 美國Branson公司；KS 260搖床 德國IKA公司；MS1602TS電子天平 瑞士梅特勒公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取5.00 g樣品（酒糟、大曲、高粱或小麥）于50 mL離心管中，加入適量提取溶劑，450 r/min搖床振蕩15 min混勻，超聲提取5 min，5 000 r/min離心5 min分層，上清液經0.45 μm濾膜過濾，4 ℃保存待測。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：HP-5毛細管色譜柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度60 ℃，以100 ℃/min升至300 ℃，保持16 min；采用恒流模式，載氣（He）流速1.0 mL/min，不分流進樣，進樣量1 μL，進樣口溫度300 ℃。

1.3.3 質譜條件

電子電離源：電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃。定性采用全掃描模式，質量掃描范圍m/z35～500；溶劑延遲：5.0 min；定量采用選擇離子掃描模式（single ion monitor，SIM），每個化合物選擇1個定量離子，2～3個定性離子。

1.3.4 定量方法

用正丁醇配制7種標準品的混合系列標準溶液，按照1.3.2、1.3.3節的方法進樣分析，以質量濃度-峰面積建立標準曲線；將色譜峰信噪比大于3的質量濃度確定為檢出限，信噪比大于10確定為定量限[25]。因本研究的重點是對酒糟中發現的生物活性物質進行定性和溯源分析，因三萜類物質含量較低、且標準品價格昂貴，在不影響生物活性物質溯源分析的前提下，只對部分化合物進行了精確定量。

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 提取劑的選擇

不同溶劑對樣品中化學成分的提取效率不同，本研究按照1.3.1節方法，在提取劑體積為10 mL及其他條件恒定下，對比乙酸乙酯、丙酮、乙醚、正己烷、正丁醇、乙醇、二氯甲烷、乙腈、甲醇對酒糟中生育酚類和甾醇類物質的提取效果，為了簡化，以7種物質（標準品）的總峰面積作為衡量指標。如圖1所示，極性溶劑的提取效果整體比非極性溶劑好，其中極性溶劑正丁醇的提取效果最好，乙酸乙酯和丙酮的提取效果相當，而非極性的溶劑乙醚和正己烷的提取效果均較差，因此選擇正丁醇作為提取劑。

圖1 提取溶劑對提取效果的影響Fig.1 Effect of solvent type on extraction efficiency

2.1.2 提取劑用量的優化

在其他條件恒定下，考察料液比對提取效果的影響，如圖2所示。采用不同料液比對目標化合物進行提取時，提取效率會隨著料液比的減小而增加（提取效率/%=酒糟中7種定量化合物提取一次的總含量/酒糟中7種化合物的實際總含量×100），在料液比為1∶3（g/mL）時，提取效率最高，達到80%，然后趨于平衡，在料液比為1∶4和1∶5（g/mL）時，提取效率均保持在80%左右。盡管在料液比為1∶1（g/mL）時，提取效率只有45%左右，但因酒糟中目標化合物的含量較低，為提高檢出限、定量的準確性、方法的經濟性與環保性，最終選擇目標化合物的峰面積最高，提取溶劑為5 mL，作為最優提取劑用量，即料液比為1∶1（g/mL）。

圖2 料液比對提取效果的影響Fig.2 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction efficiency

2.2 茅臺酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質的定性分析

采用上述優化的條件對酒糟進行提取并經GC-MS分析，通過質譜信息和保留指數比對定性，共定性茅臺酒糟中5種生育酚類、9種甾醇類和4種三萜類生物活性物質，見表1。

表1 茅臺酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質Table 1 Mass spectrometric parameters and retention indices of tocopherols, sterols and triterpenoids in Moutai distiller’s grains

文獻報道此類物質均具有一定的生物活性功能，生育酚和生育三烯酚是VE的兩大亞族，均存在α、β、γ和δ四種同分異構體[26]，其中4種生育酚均具有很強的抗氧化活性[27]，生育三烯酚則具有抗氧化、降膽固醇、抗炎和抗腫瘤等多種生物學活性[28]，其中在茅臺酒糟中發現的γ-生育三烯酚可以選擇性抑制結腸癌的發生發展[29]；麥角甾醇是決定細胞流動性的真菌細胞膜的重要組成部分，其生物合成途徑是許多抗真菌劑的靶標[30-31]；菜油甾醇是重要的制造藥物類固醇的前體[32]；豆甾醇具有免疫調節作用，在過敏性皮膚病的治療方面具有巨大潛力[33]；γ-谷甾醇具有降血脂作用[34]；羊毛甾醇是一種兩親分子，可有效阻礙晶狀體蛋白質的聚集[35]，并具有抗生物膜活性和抗群體感應活性的功能[36]；環阿屯醇具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗阿爾茨海默病等多種活性[37]，β-扶桑甾醇氧化物具有一定的抗瘧疾活性[38]；屬于三萜類的羽扇豆醇和5-麥谷蛋白-3-醇具有一定的抗癌活性[39]和良好的抗炎活性[40]；24-亞甲基環阿屯醇具有抗糖尿病作用[41]；乙酸羽扇醇酯具有與羽扇豆醇相似的生物活性和更高的生物利用度[42]，可促進皮膚修復，作為活性物質用于治療皮膚灼傷[43]。因此，本研究在茅臺酒糟中發現18種生物活性物質，不僅提高了對茅臺酒糟及茅臺酒中化學成分的認識，更為酒糟資源化利用提供了新思路。

2.3 茅臺酒糟中生育酚類和甾醇類物質的定量分析2.3.1 方法評價

按照1.3節方法、2.1節優化確定的條件及2.2節中各物質的特征離子，對其中的7種化合物進行定量，具體結構見圖3，并對同一個酒糟樣品進行連續6次相互獨立的測定，通過相對標準偏差考察方法的精密度；通過向樣品中添加適量標準品，并在優化的條件下回收提取，測定加標回收率（加標回收率/%=（加標酒糟提取的總含量-空白酒糟提取的總含量）/（加標含量×單次提取率）h100），考察方法準確度；將信噪比大于3的質量濃度確定為檢出限，信噪比大于10確定為定量限。

圖3 7種定量物質的化學結構Fig.3 Structures of 7 quantitatively analyzed substances

如表2所示，7種目標物標準曲線線性良好，R2均大于0.99；在重復性條件下連續進樣分析，酒糟中7種目標物質的相對標準偏差均不高于6.40%，方法精密度較高；平行測定酒糟樣品和向其中加入已知濃度待測組分的加標樣品，計算其加標回收率，加標回收率在88.9%～102.3%之間，加入的被測組分量可定量回收，方法準確度較高。

表2 方法評價指標Table 2 Analytical figures of merit of the developed method

2.3.2 酒糟中生育酚類、甾醇類物質的含量

酒糟中目標物質含量與第1次提取的量及提取率有關，本研究按上述優化確定的方法測定了酒糟提取液中目標物質的含量，并對同一酒糟樣品進行反復提取，直至提取液中檢測不到任何目標物質。由于正丁醇對不同化合物的提取效果不同，具體提取次數和提取結果如表3所示。酒糟經過3次提取后，儀器基本檢測不到膽甾烷醇和羊毛甾醇兩個化合物；而γ-生育酚、α-生育酚、麥角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇需提取8次，儀器才基本檢測不到。根據各提取液中目標物的含量計算第1次提取率和在酒糟中的含量，7個目標化合物的首次提取率在34.33%～58.74%，茅臺酒糟中7種生物活性物質含量為0.85～133.09 mg/kg。

表3 酒糟中生育酚類和甾醇類物質的提取結果Table 3 Effect of number of extraction cycles on contents of tocopherols and sterols in Moutai distiller’s grains

2.4 茅臺酒糟中生育酚、甾醇類和三萜類物質的來源

茅臺酒糟以高粱為主要原料，經過多輪次蒸煮和發酵，每個輪次加入適量大曲（以小麥為主要原料生產的高溫大曲），因此茅臺酒糟中的生育酚類、甾醇類和三萜類物質可能來源于高粱、大曲（小麥）或生產過程的生化反應。

表5 B班酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質含量跟蹤分析Table 5 Traceability analysis of tocopherols, sterols and triterpenoids contents in the distiller’s grains from class B

為研究茅臺酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質的來源，跟蹤分析酒糟中此類物質在1個輪次生產周期內的含量，表4、5分別為兩個不同班組各1個窖的樣品跟蹤分析結果，δ-生育酚在6輪次生產前后含量升高22.2%～32.9%，主要來自固態蒸餾過程（表4、5中“拌殼～下甑”），其他物質在1個輪次生產周期內的含量變化均較小，即生產過程的生化反應對此17種物質的貢獻小，可能主要來源于釀酒原料，即高粱或（和）大曲（小麥）。

表4 A班酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質含量跟蹤分析Table 4 Traceability analysis of tocopherols, sterols and triterpenoids contents in distiller’s grains from class A

為此，進一步分析生育酚類、甾醇類和三萜類物質在原料和大曲中的含量如表6所示，δ-生育酚在小麥和大曲中未檢出，在高粱中的含量高于酒糟，綜合確定其來自高粱和蒸餾過程；環阿屯醇、羽扇豆醇和5-麥谷蛋白-3-醇在小麥和大曲中未檢出，γ-生育酚和乙酸羽扇醇酯的含量為高粱＞酒糟＞小麥、大曲，此5種物質主要來自高粱；膽甾烷醇、β-生育酚、γ-生育三烯酚的含量為小麥＞大曲＞酒糟＞高粱，主要來自小麥；麥角甾醇在高粱和小麥中的含量均顯著低于酒糟，但在大曲中的含量較高，該物質主要來自制曲生產過程；β-扶桑甾醇氧化物在小麥中的含量高于高粱，但低于酒糟，而大曲中的含量顯著較高，該物質主要來自小麥和制曲生產過程；24-亞甲基環阿屯醇在高粱和小麥中的含量略低于酒糟，大曲中的含量較高，主要來自高粱、小麥和制曲生產過程；α-生育酚、菜油甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇、γ-谷甾醇、豆甾-5,24(28)-二烯-3-醇來自高粱和小麥的共同貢獻。

表6 原料和大曲中生育酚類、甾醇類和三萜類物質的含量Table 6 Tocopherols, sterols and triterpenoids contents in raw materials and Daqu

3 結 論

建立了酒糟中生育酚類、甾醇類和三萜類物質的分析方法，實現茅臺酒糟中5種生育酚類、9種甾醇類和4種三萜類生物活性物質的定性及其中7種物質的定量分析，完成茅臺酒糟中上述18種生物活性物質的溯源分析，確定了環阿屯醇、羽扇豆醇、5-麥谷蛋白-3-醇、γ-生育酚、乙酸羽扇醇酯主要來自高粱，膽甾烷醇、β-生育酚、γ-生育三烯酚主要來自小麥，δ-生育酚主要來自高粱和蒸餾過程，β-扶桑甾醇氧化物主要來自小麥和制曲生產過程，麥角甾醇主要來自制曲生產過程，24-亞甲基環阿屯醇主要來自高粱、小麥和制曲生產過程，α-生育酚、菜油甾醇、豆甾醇、羊毛甾醇、γ-谷甾醇、豆甾-5,24(28)-二烯-3-醇來自高粱和小麥的共同貢獻。