高通量測序分析沙棘酵素自然發酵過程中細菌多樣性

張 琪，朱 丹，牛廣財,3,*，顏飛翔，魏文毅,3，朱 磊,3，王思溥

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江省農產品加工工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）又名醋柳、酸刺，是胡頹子科沙棘屬落葉灌木或小喬木，其果實為球形或近卵形小漿果，為橘黃色或橘紅色[1]，素“長壽果”、“神果”和“圣果”之美譽，也是珍貴的藥食同源植物，收錄于《中國藥典》[2]。沙棘果實含有黃酮類、多酚類、多糖類、維生素類、不飽和脂肪酸、氨基酸、5-羥色胺等多種營養成分和生物活性物質[3-5]，廣泛應用于食品和保健品等領域，具有增強人體免疫力，抗疲勞、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、預防心腦血管疾病等多種生理功能[6-8]。

高通量測序技術代替了傳統上微生物分析所采用的分離培養方法，該過程無需分離純化，就可一次性對樣品中的幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，可快速確定其中微生物的種類和豐度[9]，具有測定速度快、結果精準、利用微量樣品即可實現所有微生物的檢測等優點，能夠更精確分析樣品中微生物群落多樣性和相應的功能分析。該技術應用范圍較廣泛，主要在人類疾病與健康、海洋、植物多樣性、發酵食品、環境檢測等多個領域[10-15]。近年來，利用該技術研究微生物分子生態學已成首選方法，可以全面揭示樣本微生物種群組成及其多樣性[16]。吳進菊等[17]對襄陽大頭菜發酵過程中細菌的多樣性進行了研究，結果顯示絕對優勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），相對豐度分別為26.14%～78.12%和8.33%～70.12%，而在屬水平上，優勢菌屬分別為鹽厭氧菌（Halanaerobium）、弧菌（Vibrio）、鹽單胞菌（Halomonas）、乳桿菌（Lactobacillus）和色鹽桿菌（Chromohalobacter）。高慶超等[18]采用高通量測序技術研究黑果枸杞酵素在自然發酵過程中微生物的動態變化，共檢測出26種已知的細菌門，48種已知的細菌屬，其中0 d優勢菌門為Proteobacteria，占比約為99%，主要菌屬為泛菌（Pantoea）71.35%、假單胞菌（Pseudomonas）14%、歐文氏菌（Erwinia）6.61%；發酵第10、20、30、40、50、60天Firmicutes為優勢菌門，占比為96.9%～99.1%。

食用植物酵素以植物為原料，經微生物發酵制得的含有特定生物活性成分（多糖類、寡糖類、蛋白質及多肽、氨基酸類、維生素類等）可食用的酵素產品[19]。目前，國內酵素產業多以天然發酵為主。但該種方式受環境條件影響較大，發酵過程中微生物的菌群比較復雜，產品質量較難控制。因此，研究自然發酵食用酵素中微生物菌群的變化規律，是篩選酵素優良與優勢菌種的基礎。截至目前，鮮見有關沙棘酵素自然發酵過程中微生物群落結構多樣性方面研究報道。本實驗基于高通量測序技術，對不同發酵階段的沙棘酵素中細菌種群組成及多樣性進行研究，以期開發和應用酵素優良菌種，為沙棘酵素的可控發酵、安全高效生產和品質提升提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍大果沙棘，黑龍江省孫吳縣寶江大果沙棘展銷中心提供。

Pectinex BEXXL果膠酶（酶活力10 000 U/mL）諾維信（中國）生物技術有限公司；FastDNA?Spin Kit for Soil型號DNA抽提試劑盒 美國MP Biomedicals公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；FastPfuPolymerase北京TransGen公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit美國Axygen公司；NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit建庫試劑盒 美國Bioo Scientific公司；MiSeq Reagent Kit v3測序試劑盒 美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

N13462C移液器、5424R高速臺式冷凍離心機德國Eppendorf公司；ELx800酶標儀 美國BioTek公司；Quantus? Fluorometer微型熒光計 美國Promega公司；DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠；GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 采集流程

沙棘酵素自然發酵法制備：首先將-20 ℃冷凍的大果沙棘在常溫下解凍，用打漿機進行打漿，用Pectinex BEXXL果膠酶進行酶解，酶解條件為2.0 mL/kg的添加量，于45 ℃酶解4 h[20]；用白砂糖調整糖度至21 °Brix[21]后，在22 ℃恒溫條件下進行自然發酵。

沙棘酵素樣品的采集：在發酵72～1 584 h期間，根據其還原糖、體積分數和pH值等指標進行分階段取樣，發酵第72小時第1次取樣，命名為發酵前期（F22_Q），發酵第624小時第2次取樣，命名為發酵中期（F22_Z），發酵1 584小時第3次取樣，命名為發酵后期（F22_H）。取樣方法是將發酵液在錐形瓶中混合均勻，然后取15 mL于離心管中，置-80 ℃冰箱中冷凍，用于微生物測序。

1.3.2 理化指標的測定

還原糖含量：采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定[22]；乙醇：參照GB 5009.225ü2016《酒中乙醇濃度的測定》酒精計法測定[23]；pH值：采用酸度計法測定。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳

檢測前將樣品在冰上融化后，充分混勻并離心，取3 μL上樣檢測。檢測條件為2%瓊脂糖膠、電壓5 V/cm、時間20 min。

1.3.4 DNA抽提和PCR擴增

根據說明書進行微生物群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量，使用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度；使用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對16S rRNA基因V3-V4可變區進行PCR擴增。擴增程序如下：95 ℃預變性3 min，30個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），然后72 ℃穩定延伸10 min，最后在10 ℃進行保存。PCR體系為：5hFastPfuBuffer緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，FastPfuPolymerase DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補足至20 μL。每個樣本3個重復。

1.3.5 Illumina MiSeq測序

利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺進行測序，該部分送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行操作。

1.4 數據處理

使用Trimmomatic軟件原始測序序列進行質控，使用FLASH軟件進行拼接；然后使用UPARSE軟件，根據97%的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋，細菌比對采用Silva數據庫（SSU128）；根據OTU聚類分析結果，采用Mothur計算分析樣品的α多樣性，包括Sobs指數、Shannon指數、Simpson指數、ACE指數、Chao指數和覆蓋率；利用R語言進行菌群多樣性分析，并繪制柱狀圖、Venn圖和熱圖[24]，結合基于Bary-Curtis距離算法的主成分分析（principal component analysis，PCA）圖分析微生物結構組成差異。

2 結果與分析

2.1 沙棘酵素發酵過程中主要理化指標的變化

由圖1可知，還原糖質量分數由初始值21.1%呈現持續下降趨勢，至發酵后期還原糖質量分數降為10.3%；乙醇體積分數的變化正好與之相反，在發酵前期增長較快，在624 h之后保持穩定，在1 584 h達到4.24%；還原糖含量下降速度比較均勻，說明在發酵過程中，發酵液中的微生物能夠充分利用糖類物質，消耗糖類而產生乙醇或者其他物質；pH值在整個發酵中呈先上升后下降的趨勢，這可能與一些微生物將有機酸作為替代碳源被部分消耗有關[25]。

圖1 沙棘酵素發酵過程中的還原糖含量、乙醇體積分數和pH值的變化Fig.1 Changes in the contents of reducing sugar and alcohol and pH during the fermentation of sea buckthorn jiaosu

2.2 瓊脂凝膠電泳鑒定

沙棘酵素自然發酵過程中不同發酵階段的發酵液中細菌16S rRNA PCR擴增產物瓊脂凝膠電泳結果如圖2所示，沙棘酵素自然發酵共分為3個階段（F22_Q、F22_Z、F22_H）9個樣本的PCR擴增產物條帶在500 bp左右，與設計引物擴增長度接近，特異性和亮度均較好，可滿足下一步的測序要求。

圖2 沙棘酵素發酵液細菌PCR擴增結果電泳圖Fig.2 Electrophoresis images of PCR amplified products of bacterial 16S rRNA gene from sea buckthorn jiaosu

2.3 高通量測序結果分析

2.3.1 測序樣本數據分析

沙棘酵素自然發酵過程中的3個不同發酵階段樣品，經測序后對數據進行分析，根據序列擴增區域338F_806R，可得到原始序列信息，經優化后得到的序列信息如表1所示。通過Illumina MiSeq高通量測序平臺整理原始數據，并進行統計優化，沙棘酵素自然發酵樣品優化序列范圍為38 917～70 982 條，平均長度范圍為403.10～418.10 bp，與設計引物擴增長度接近。由于平行樣本之間存在誤差，但是誤差較小，在允許誤差范圍內，所以數據樣本具有有效性，質控合格。

表1 樣本測序結果Table 1 Results of bacterial 16S rRNA gene sequencing

2.3.2 測序樣本結果分析

稀釋曲線主要利用各沙棘酵素樣品在不同測序深度時的微生物α多樣性指數構建曲線，以此反映各樣品在不同測序數量時的微生物多樣性。圖3、4為沙棘酵素自然發酵過程中不同發酵階段細菌的稀釋曲線圖。如圖3所示，在測序深度小于20 000時，隨著序列數不斷增加，Sobs指數顯著增加，但是當序列數介于20 000～40 000時，Sobs指數緩慢增加，最終曲線趨向平坦，說明測序數據量合理。如圖4所示，在測序數據量0～40 000范圍內，Shannon指數曲線趨向平坦，說明測序數據量足夠大，可以反映樣本中絕大多數的微生物多樣性信息。

圖3 Sobs指數稀釋曲線Fig.3 Rarefaction curves of Sobs index

圖4 Shannon指數稀釋曲線Fig.4 Rarefaction curves of Shannon index

2.3.3α多樣性分析

為保證測序序列的均一性，按照最小樣本進行抽平后，根據分類單元個數統計，得到1個域，1個界，25個門，57個綱，149個目，239個科，422個屬，601個種，744個OTU。α多樣性分析可以反映樣本中微生物群落的豐富度和多樣性，α多樣性中包含能夠估計環境群落的物種豐度和多樣性的相關指數。由表2可知，細菌中覆蓋率均不小于99.97%，菌落的覆蓋率很高，說明本次測序的樣品數據能夠覆蓋當前沙棘酵素發酵液中細菌的種類，完全能夠代表樣本中細菌的真實情況。在整個發酵階段，Shannon指數呈現逐漸升高的趨勢，而Simpson指數變化趨勢正好與其相反，說明隨著發酵的進行，群落的細菌多樣性逐漸豐富，在發酵后期達到最高；ACE指數和Chao指數反映的是群落的豐富度，這兩個指數也是逐漸增加，說明隨著發酵的進行，沙棘酵素酵液中物種的種類逐漸增多。

表2 細菌α多樣性指數Table 2 Bacterial α diversity indexes

2.3.4 細菌OTU分布

根據不同的相似度水平，對所有序列進行OTU劃分，對97%相似水平下的OTU進行生物信息統計分析。由圖5可知，前期（F22_Q）、中期（F22_Z）和后期（F22_H）含有OTU數分別為99、280、325，其中特有的OTU數分別為8、85、124。由此可見，隨著沙棘酵素自然發酵的進行，OTU數呈現顯著增加的趨勢，說明細菌菌群的豐富度和多樣性在逐漸提高，這與多樣性指數的分析結果一致，說明沙棘酵素在其自然發酵的整個過程中細菌群落變化較大。

圖5 沙棘酵素自然發酵過程中細菌OTU Venn圖Fig.5 Venn diagram showing unique and shared bacterial OTU between three fermentation stages of sea buckthorn jiaosu

2.3.5 基于門水平細菌群落結構差異性分析

在門水平上沙棘酵素在自然發酵過程中細菌群落結構如圖6所示，在沙棘酵素自然發酵過程中共檢出744個OTU，25個門，422個細菌屬，其相對豐度大于1%的細菌門共5種，分別為藍藻細菌門（Cyanobacteria）、Proteobacteria、未知細菌門（unclassified_k__norank_d__Bacteria）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、Firmicutes。由圖6可知，Cyanobacteria是沙棘酵素整個發酵過程中的第一大絕對優勢菌門，占據主導作用，是沙棘酵素前期（F22_Q）、中期（F22_Z）和后期（F22_H）3個不同發酵階段的絕對優勢菌門，其相對豐度分別為93.28%、66.59%和35.40%；Proteobacteria為第2大優勢菌門，相對豐度為6.60%～33.29%，該菌門在植物土壤中較為常見[26-27]，可能是沙棘果在采摘過程中攜帶環境微生物所致。隨著發酵的進行，在中期（F22_H）和后期（F22_Z）階段，該Proteobacteria呈增加趨勢，由此也可以看出，沙棘酵素自然發酵過程中細菌群落結構的不均一性。

圖6 細菌群落在門水平上的相對豐度Fig.6 Relative abundance of bacterial communities at the phylum level

2.3.6 基于屬水平細菌群落結構差異性分析

在屬水平上沙棘酵素在自然發酵過程中細菌群落結構如圖7所示，其相對豐度大于1%的細菌屬共有5種，分別為：norank_f__norank_o__Chloroplast、雷爾氏菌（Ralstonia）、unclassified_k__norank_d__Bacteria、norank_f__Mitochondria、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia。在發酵前期（F22_Q），norank_f__norank_o__Chloroplast為主要優勢菌屬，相對豐度達到93.28%，雖然在整個發酵過程中，該菌屬豐度逐漸減少，盡管在后期（F22_H）減少至35.39%。但是，該菌屬在整個發酵過程占比卻始終處于優勢地位，為絕對優勢菌屬。隨著發酵的進行，Ralstonia也屬于優勢菌屬，在沙棘酵素自然發酵各階段相對豐度依次為1.43%（F22_Q）＜21.45%（F22_Z）＜29.37%（F22_H）；另一種優勢菌屬為unclassified_k__norank_d__Bacteria，在各階段的相對豐度依次為0%（F22_Q）＜4.02%（F22_Z）＜27.98%（F22_H）。

圖7 細菌群落在屬水平上的相對豐度Fig.7 Relative abundance of bacterial communities at the genus level

2.3.7 基于屬水平不同發酵階段熱圖分析

熱圖是以顏色梯度表征二維矩陣或表格中的數據大小，并呈現群落物種組成及物種的豐度信息，通過色塊顏色梯度展示樣本中不同物種的豐度變化情況[28]。由圖8可知，沙棘酵素自然發酵的3個不同階段的樣本有所差異，其中，分類水平總相對豐度排在前10 位的菌屬分別為norank_f__norank_o__Chloroplast、Ralstonia、unclassified_k__norank_d__Bacteria、norank_f__Mitochondria、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Rhodococcus、Pelomonas、Anaerocolumna、Acinetobacter、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium。3個發酵階段的主要優勢菌屬相同，均為norank_f__norank_o__Chloroplast屬，在發酵前期、中期和后期3個階段占比分別為93.55%、67.67%和36.46%；除發酵后期（F22_H）第2優勢菌屬為norank_f__Mitochondria外，其他兩個階段（F22_Q、F22_Z）的第2大菌屬均為Ralstonia。不同發酵階段細菌群落結構組成具有一定差異性，雖然有些菌屬結構類似，但是含量卻均有不同，說明沙棘酵素發酵液中細菌群落結構的多樣性，這與細菌群落在屬水平上占比的分析結果一致。

圖8 細菌屬水平群落結構熱圖Fig.8 Heatmap of bacterial community structure at the genus level

2.3.8β多樣性分析

2.3.8.1 樣本層級聚類分析

為研究沙棘酵素自然發酵不同階段群落結構的相似性或差異關系，對3個發酵階段群落距離矩陣進行聚類分析。如圖9所示，3個發酵階段可聚為兩類，即F22_Q和F22_Z聚為一類，F22_H聚為一類，其中發酵前期（F22_Q）的優勢菌屬為：norank_f__norank_o__Chloroplast、norank_f__Mitochondria、Ralstonia，相對豐度依次為93.28%、4.90%和1.43%；中期（F22_Z）為norank_f__norank_o__Chloroplast、Ralstonia、unclassified_k__norank_d__Bacteria、norank_f__Mitochondria、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，相對豐度依次為：66.59%、21.45%、4.02%、3.30%和1.41%；后期（F22_H）為norank_f__norank_o__Chloroplast、Ralstonia、unclassified_k__norank_d__Bacteria、norank_f__Mitochondria、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，相對豐度依次為35.39%、29.37%、27.98%、0.88%和0.95%。總體而言，在前期和中期發酵的細菌群落結構較為相似，原因可能是這兩個時期溶液的滲透壓比較大，而后期隨著微生物的生長和代謝，使其環境發生變化[29]，從而細菌的豐度產生差異。

圖9 基于聚類分析和屬水平沙棘酵素發酵樣品中的細菌群落結構分析Fig.9 Analysis of bacterial community structure at the genus level in sea buckthorn jiaosu samples based on cluster analysis

2.3.8.2 沙棘酵素自然發酵液中細菌群落PCA

基于屬水平，對沙棘酵素發酵液中菌屬進行PCA，結果如圖10所示，PC1的貢獻率為28.68%，PC2的貢獻率為20.43%。在PCA中，各個點之間的距離越大，表明它們之間的菌群差異越大[30]。反之，樣本點越接近，表明兩樣本物種組成則越相似[31]。在3個平行樣本中，F22_Q的樣本之間距離非常小，表明發酵初始階段組內的差異非常小，而F22_Z和F22_H組內距離較大，說明這兩個樣本的組內差異較大，原因是中后期沙棘酵素發酵液的環境較復雜，菌屬分布不均勻所致；從整體看，這3個發酵階段組間差異較大，說明沙棘酵素不同發酵階段的細菌群落結構差異性比較大。根據圖10分組可知，發酵前期（F22_Q）和中期（F22_Z）聚為一類，發酵后期（F22_H）聚為一類，這與樣本層級聚類分析結果相同。

圖10 細菌群落PCAFig.10 PCA plot of bacterial community

2.3.9 沙棘酵素發酵中還原糖、乙醇和pH值與優勢菌屬間的相關性

由圖11可知，細菌的群落結構中相對豐度大于1%的優勢菌屬與發酵過程中還原糖含量、乙醇體積分數和pH值指標間具有一定的相關性。其中，沙棘酵素發酵前期的norank_f__norank_o__Chloroplast和norank_f__Mitochondria與還原糖含量呈顯著正相關（P＜0.05），與乙醇體積分數和pH值呈顯著負相關（P＜0.05），而發酵中后期的Ralstonia和unclassified_k__norank_d__Bacteria則正好相反，即與還原糖含量的變化呈顯著負相關（P＜0.05），與乙醇體積分數和pH值則呈顯著正相關（P＜0.05）。說明沙棘酵素自然發酵中norank_f__norank_o__Chloroplast、norank_f__Mitochondria、Ralstonia和unclassified_k__norank_d__Bacteria對發酵液中還原糖、乙醇和pH值的影響顯著。

圖11 沙棘酵素發酵過程中還原糖、乙醇和pH值與優勢菌屬間的相關性熱圖Fig.11 Heatmap of the correlation between reducing sugar content,alcohol content, pH and dominant bacteria during the fermentation of sea buckthorn jiaosu

3 討 論

通過Illumina高通量測序方法，分析了沙棘酵素自然發酵過程中細菌結構及多樣性變化。結果顯示，隨著發酵的進行，細菌群落結構越來越復雜，菌株種類越來越多。在發酵前期、中期和后期獨有OTU數分別為8、85和124，細菌菌群的豐富度和多樣性在逐漸提高。其中，norank_f__norank_o__Chloroplast在整個發酵過程中是絕對優勢菌屬，雖然隨著發酵進行，該菌屬呈現逐漸下降的趨勢，相對豐度由前期的93.28%降至中期的66.59%和后期的35.40%，而Ralstonia屬和unclassified_k__norank_d__Bacteria在中后期的相對豐度則持續升高。說明該溫度下，這幾種菌屬較適宜此發酵液中的環境，特別是沙棘果較高的酸性條件，也可能是發酵前期，由于發酵液中的含糖量較高，導致微生物所處環境的滲透壓較高，而norank_f__norank_o__Chloroplast和norank_f__Mitochondria發酵前期豐富度較高的菌屬，能夠在此環境下較好利用糖類物質，但是隨著糖類物質的消耗，發酵液中滲透壓的降低，發酵環境發生改變，其他微生物開始生長繁殖，導致微生物的結構及多樣性變得豐富起來。由相關性分析可知，本研究中norank_f__norank_o__Chloroplast、norank_f__Mitochondria、Ralstonia和unclassified_k__norank_d__Bacteria等菌屬與沙棘酵素中還原糖、乙醇和pH值的相關性顯著。

沙棘酵素發酵中細菌群落來源可能與沙棘果在采摘時接觸土壤、樹體而帶來的生長環境中微生物有關。此外，由于沙棘果漿在自然發酵前，尚未經過滅菌處理，在解凍和打漿過程中也會有周圍環境中微生物的參與。在發酵前期（F22_Q），細菌群落結構比較單一，以norank_f__norank_o__Chloroplast為絕對優勢菌屬，其次有少量的norank_f__Mitochondria和Ralstonia；在發酵中后期，細菌群落結構具有一定的差異性；而通過細菌OTUVenn圖可知，細菌菌群的豐富度和多樣性均呈現升高的趨勢，從而更有力的展示了沙棘酵素自然發酵過程中細菌群落結構的演替規律。很多植物類酵素在自然發酵中，其微生物的結構和豐度都會有非常明顯的變化，例如，黑果枸杞酵素自然發酵過程中，在發酵0～20 d細菌群落多樣性和豐富度相對較高，在發酵30～50 d真菌群落多樣性和豐富度相對較高，在其自然發酵中主要優勢細菌為Lactobacillus[27]；蘋果自然發酵酵素中的細菌多樣性前期最高，呈先降低后升高的趨勢，細菌主要有Lactobacillus、葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter）、乳酸乳球菌（Lactococcus）、魏斯氏菌（Weissella）、明串珠菌（Leuconostoc）和醋酸菌（Acetobacter）[32]；在大頭菜發酵過程中，Proteobacteria和Firmicutes占據了絕對的優勢，在發酵前期，Vibrio為優勢菌屬，而隨著發酵的進行，弧菌屬相對豐度急劇下降，Halanaerobium成為相對豐度最高的優勢菌屬，而Halomonas、Chromohalobacter和norank＿f＿TBZ33也是發酵后期的優勢菌屬[17]。由此可見，植物酵素在自然發酵過程中，由于原料不同，發酵條件差異較大，所涉及的微生物種類多，在不同發酵階段各種微生物的作用以及作用機制還有待進一步研究。

4 結 論

通過Illumina MiSeq測序對沙棘酵素自然發酵前期（F22_Q）、中期（F22_Z）和后期（F22_H）3個時期樣本進行分析，根據分類單元個數統計得744個OTU，25個門，42個細菌屬。在門水平上共有5種優勢菌門，分別為Cyanobacteria、Proteobacteria、unclassified_k__norank_d__Bacteria、Acidobacteriota、Firmicutes，其中，Cyanobacteria為絕對優勢菌門，在3個發酵階段的相對豐度分別為93.28%、66.59%和35.40%；在屬水平上共有5種優勢菌，分別為norank_f__norank_o__Chloroplast、Ralstonia、unclassified_k__norank_d__Bacteria、norank_f__Mitochondria、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，其中，norank_f__norank_o__Chloroplast菌屬在整個發酵過程相對豐度均處于領先地位，其相對豐度范圍為35.39%～93.28%；通過β多樣性中的樣本層級聚類分析和PCA得出，3個發酵階段可聚為兩類，F22_Q和F22_Z聚為一類，F22_H為一類。這為后續沙棘酵素的發酵提供重要理論基礎，同時對沙棘酵素的生產工藝等具有深遠影響。本研究揭示了沙棘酵素自然發酵過程中細菌群落的動態演替，為研制高效酵素發酵劑，提高沙棘酵素產品質量提供了的理論基礎。