基于非靶向代謝組學分析副干酪乳桿菌發酵枸杞汁各階段代謝差異

胡明珍，劉慧燕，潘 琳，王 彤，李旭陽，王艷萍，方海田*

（寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）是管狀花目茄科枸杞屬植物，耐寒及抗旱能力強，多生長于堿性沙質土壤，在我國主要分布于中北部地區。且寧夏枸杞是唯一載入2010年版《中國藥典》的品種。其果實被稱為枸杞子，又名枸杞豆、枸杞子等，是藥食同源的植物資源[1-2]。枸杞果實中含有多種豐富的活性成分，具有降血糖、抗氧化、增強免疫力等作用[3-4]。由于枸杞本身并無特別突出的香味，以枸杞為原料生產的枸杞原漿風味欠佳，嚴重地影響了枸杞類飲品的生產和開發。

乳酸菌能利用可發酵碳水化合物產生大量乳酸[5]，可以通過對不同底物發酵而制作不同的發酵食品，如發酵乳制品、發酵肉制品、發酵蔬菜等[6]。相關研究表明，菌株在發酵過程中不僅能提高原料中不同營養物質的含量，還可以改善發酵制品的風味[7]。副干酪乳桿菌是一種廣泛存在于發酵制品中的兼性厭氧微生物，有良好的調節腸道菌群[8]、抗氧化[9]和增強免疫力等功能[10]。用副干酪乳桿菌發酵果蔬產品，不僅能保留其原有的營養成分，還能提高有機酸、細菌素、多糖等多種活性成分的含量[11-12]。

代謝組學是基于不同生長環境、時期以及外界刺激下的生物樣品中有機酸等低分子質量代謝產物為研究對象，通過高通量檢測和數據處理，進行信息整合及生物標記物鑒定的科學[13]，已被廣泛應用于食品研究中。張啟力等[14]基于植物代謝組學技術從整體化學組成上分析了青海產區枸杞子的化學特征。楊孟可等[15]針對人工接種枸杞癭螨，利用液相色譜-質譜聯用技術比對分析枸杞癭螨致癭后枸杞葉片初生和次生代謝產物的變化。對枸杞發酵產品的研究多關注于枸杞中揮發性成分及其香氣特征[16]，但運用代謝組學技術分析不同時期益生菌發酵枸杞代謝物組分及差異的報道很少。

本實驗以寧夏枸杞為原料，采用從傳統發酵漿水中分離出的1 株乳酸菌進行枸杞汁液態發酵，研究發酵液中代謝產物的變化。采用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）非靶向代謝組學方法研究不同階段枸杞發酵液中的代謝組分，結合多元統計分析方法篩選差異代謝物，分析相關的代謝通路，旨在為植物發酵過程中化學物質表征和功能成分研究提供有效研究策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧夏甲級枸杞干果為寧夏中寧市售（2020年）；MRS（De Man Rogosa Sharpe）肉湯培養基 青島高科技工業園海博生物技術有限公司；水、甲醇（均為色譜級） 美國Fisher Chemical公司；甲氧胺鹽酸鹽上海阿達瑪斯試劑有限公司；硅烷化試劑BSTFA（1%TMCS） 美國Regis Technologies公司；氯仿（色譜級） 上海沃凱化學試劑有限公司；D-異抗壞血酸鈉（食品級）、果膠酶、過硫酸鉀、乙醇、無水碳酸鈉（均為分析純） 銀川偉博鑫生物科技有限公司。

采集甘肅隴南地區農家自然發酵漿水，通過純培養技術篩選樣品中的乳酸菌并保藏。由16S rDNA序列分析測定各菌株堿基序列，并與NCBI網站中的BLAST程序進行核酸序列的同源性比對，同源性均達到99%以上，確定分離菌種分別為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），并命名為副干酪乳桿菌NXU-19004，保藏于寧夏大學食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室。該菌株37 ℃培養14 h時達到穩定期，活菌數達1.24h108CFU/mL，pH 2條件下存活率達（87.35f0.43）%，耐受0.5%牛膽鹽存活率達（65.68f2.86）%。

1.2 儀器與設備

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司；LRH-250 生化培養箱 廣東省醫療器械廠；靜音真空高速破壁機 九陽股份有限公司；Wonbio-96c多樣品冷凍研磨儀 上海萬柏生物科技有限公司；NewClassic MS電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；高速冷凍離心機、手動單道移液器 德國Eppendorf公司；JXDC-20氮吹儀 上海凈信實業發展有限公司；8890B-5977 GC-MS聯用儀 美國Agilent公司；恒溫振蕩器 上海葉拓儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與擴大培養

將保存于脫脂乳中的5 株乳酸菌分別劃線接入MRS固體培養基上， 37 ℃恒溫培養48 h后取出。挑取1 環固體培養基上生長較好的單菌落接種至MRS液體培養基中，37 ℃恒溫培養24 h后取出，并按照2%接種量（體積分數）將菌液接入液體培養基中進行擴大培養（37 ℃，24 h），在充分活化兩代后將菌液離心（4 ℃，3 000 r/min，5 min），傾去培養基，用無菌水洗滌沉淀2次后得到菌泥，再將其轉入無菌水中振蕩均勻，活菌數可達106CFU/mL以上，得到菌懸液放入4 ℃冰箱備用。

1.3.2 發酵枸杞汁的制備

挑選肉厚、無腐爛的寧夏枸杞干果，用流動水多次沖洗枸杞表皮，洗掉黏在枸杞表面的污垢后，以純水與枸杞干果5∶1（mL/g）加水，并加入0.05%的異抗壞血酸鈉護色后，室溫浸泡8～9 h。再加入0.15%的果膠酶后打漿，用3 層無菌紗布和漏斗過濾除籽。加入5%白砂糖后，添加10%的檸檬酸調pH值至4.5，分裝于玻璃瓶中，每瓶100 mL，用紗布球和報紙封口，在55 ℃條件下殺菌25 min后備用。將滅菌后的枸杞汁取出，冷卻后接入培養好的菌株，接種量為5%，靜置于37 ℃條件下發酵14 h，得到成品。

1.3.3 樣品制備與處理

以發酵后樣品中乳酸產量為評價指標，對接種副干酪乳桿菌NXU-19004的枸杞發酵液每間隔2 h進行取樣，分別選取滅菌后未接入菌液的枸杞汁、接菌發酵0 h、接菌發酵10 h和接菌發酵22 h的枸杞發酵液，共4 組待測樣本。同時制備了質控樣品（由每個分析樣品各取部分混合而成），通過GC-MS聯用進行代謝組學分析。

發酵樣品前處理：取發酵液于10 mL離心管中，渦旋振蕩混勻后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取1 000 μL樣品加入800 μL乙酸乙酯，渦旋30 s混勻后，冰水浴超聲萃取30 min。將樣品于-20 ℃靜置30 min，然后4 ℃、13 000hg離心15 min，取上清液，裝入1.5 mL離心管中；再加入700 μL乙酸乙酯重復萃取一次，合并兩次上清液氮氣吹干，加入200 μL乙酸乙酯復溶，渦旋2 min后，冰水浴超聲10 min，4 ℃、13 000hg離心10 min。取上清液至進樣小瓶中進行GC-MS代謝組學分析。

1.3.4 GC-MS分析

色譜條件：樣本用不分流模式注入GC-MS系統進行分析，進樣量1 μL。樣品經Agilent 122-5532G DB-5MS毛細管柱（40 mh0.25 mm，0.25 μm）分離后進入質譜檢測。進樣口溫度260 ℃，載氣為高純氦氣，載氣流速1 mL/min，隔墊吹掃流速3 mL/min，溶劑延遲5.5 min。升溫程序：初始溫度60 ℃，平衡0.5 min，然后以8 ℃/min的速度升至310 ℃，并維持6 min。

質譜條件：電子電離源，傳輸線溫度310 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式（SCAN），質量掃描范圍m/z50～500，掃描頻率為3.2 scan/s。

1.4 數據處理

所有的GC-MS圖譜使用MassHunter workstation Quantitative Analysis（v10.0.707.0）軟件進行峰提取、對齊等數據預處理操作，并將得到的數據輸入ropls（Version1.6.2）軟件，使用R2和Q2進行主成分分析（principal components analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），根據Studentt檢驗的P值小于0.05，同時PLS-DA模型PC的計算變量投影重要性分析值（variable importance in the projection，VIP）＞1，進行差異性代謝物的篩選。對篩選出的差異代謝集，通過關聯分析、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路數據庫通路分析、聚類分析等高級分析手段進行生物學信息挖掘。

2 結果與分析

2.1 不同階段枸杞發酵液代謝物PCA

采用PCA對優化條件下，從未接菌枸杞汁、接菌發酵0 h、接菌發酵10 h和接菌發酵22 h的4個不同時間段的枸杞發酵液進行差異分析，從總體上反應了各組樣本之間的總體差異和組內樣本之間的變異度大小。樣本通過降維分析后，在PC1、PC2上有相對坐標點，各個坐標點距離代表了樣本間聚集和離散程度；置信橢圓表示本組“真實”樣本在95%置信度下，分布在此區域內；超過此區域可認為是可能異常樣本。如圖1所示，4 組發酵液樣品以及質控樣品樣本組的平行樣本聚在一起，表明所有檢測具有良好的分析穩定性和實驗重現性；同時，PC1和PC2貢獻率分別為53.80%和19.60%，兩者累計貢獻率達到73.40%，可見各時間內枸杞發酵液之間分離趨勢較明顯，從整體上反映出這些樣品之間的代謝物差異。

圖1 不同階段枸杞發酵液樣本PCA模型得分圖Fig.1 PCA score plot of fermented goji juice samples at different fermentation times

2.2 不同階段枸杞發酵液代謝物PLS-DA

PLS-DA通過對PC適當旋轉，可以有效對組間觀察值進行區分，并且能夠找到導致組間區別的影響變量[17]。常用來直觀地展示模型的分類效果，圖中兩組樣品分離程度越大，說明分類效果越顯著。進一步采用PLS-DA對構建的模型進行驗證，4個時間點內枸杞發酵液樣本PLS-DA得分圖和置換檢驗結果如圖2所示，其結果與PCA相似，正離子模式下所建模型對發酵液的累計判別解釋能力R2X=0.884，R2Y=0.985，對模型預測能力Q2=0.949，這3個指標越接近于1時表示模型越穩定可靠，模型的擬合度較好。同時采用n=200的隨機置換檢驗（圖3），可見模型隨著置換保留度下降，R2和Q2下降，回歸線呈向上的趨勢，且位于最右邊的R2和Q2值均超過0.9，Q2回歸線的截距為-1.007 9，說明置換檢驗過關，模型不存在過擬合現象，具有很好的穩定性和預測性，適合探索接種乳酸菌后枸杞汁發酵過程中的代謝物差異。

圖2 不同階段枸杞發酵液樣本PLS-DA得分圖Fig.2 PLS-DA score plot of goji juice fermented for different times

圖3 不同階段枸杞發酵液樣本置換檢驗圖Fig.3 Permutation test of giji juice fermented for different times

2.3 差異代謝物的篩選與分析

根據PLS-DA模型結果，將t檢驗P值小于0.05的代謝物作為篩選標準。結合METLIN、HMDB等在線數據庫通過化合物的精確m/z和保留時間進行代謝物的鑒定，結果如表1所示，從4個階段的枸杞發酵液中共篩選出14 大類63種差異代謝物，差異代謝物的種類由多到少為有機酸及其取代衍生物、氨基酸及其衍生物、羧酸及其衍生物、脂肪酰基、類黃酮、呋喃、咪唑嘧啶、吲哚及其衍生物、非金屬氧陰離子化合物、酚酸類、三萜類、吡啶及其衍生物等。

表1 不同階段枸杞發酵液中差異代謝物含量Table 1 Contents of differential metabolites in goji juice fermented for different times

有機酸類在枸杞發酵液中不僅具有呈香作用，同時也可在發酵過程中抑制雜菌。枸杞發酵液中的有機酸一部分來源于發酵前酸度調節，另一部分來源于乳酸菌發酵過程中微生物代謝產生。如苯甲酸和苯甲醛等可用作果汁飲料的定香劑和香料[18]，也可用以調和香精以及香料的制備。但也有一些產生不良風味的物質，如硫氰酸芐酯[19]，從未接菌到接種乳酸菌發酵22 h過程中，其平均相對豐度隨時間的延長而降低，且在所有差異代謝物中含量最高。游離氨基酸是菌株代謝過程中生成的重要組分，一些游離氨基酸不僅具有生物活性[20]，還具有鮮、甜、苦、澀、酸等特殊滋味[21]。從4個階段枸杞發酵液中篩選出的氨基酸差異代謝物有脯氨酸、N-甲基丙氨酸、肌氨酸、丙氨酸，均屬于甜味氨基酸，在接種發酵過程中其平均相對豐度均呈上升趨勢，可改善枸杞經乳酸菌發酵產生的有機酸的酸味，對枸杞汁的發酵風味及感官品質的形成具有重要貢獻。黃酮類化合物廣泛分布于豆科植物中，能帶給發酵產品愉快的香氣[22]，主要為3-羥基黃酮。差異代謝物中以角鯊烯為主的三萜類物質不僅具有生理調控功能[23]，還具有防御功能[24]。

續表1

2.4 差異代謝物的聚類分析

代謝物分布可在視覺上分為上調和下調[25]。為了直觀觀察不同發酵階段差異代謝物的濃度變化趨勢，依據每個差異代謝物的相對含量作出熱圖（選取代謝物含量較高的前35個物質），如圖4所示，根據上方樣本聚類的樹狀圖，可以分成兩個區域，發酵22 h的6個平行樣本為第1區域，未發酵、發酵0 h和發酵10 h為第2區域，可見發酵22 h后的代謝物顏色比其他3個階段深，而這3 組中發酵10 h后的代謝物豐度又遠超過其他兩組，可見兩個樣本分支離的越近，說明這兩個樣本所有代謝物的表達模式越接近，即代謝物表達量變化趨勢越接近。從最左圖中可以看出發酵組（FGJF_22h）高含量差異代謝物超過50%，明顯多于對照組（UFGJ2），其中發酵組中的有機酸及其取代衍生物、氨基酸及其衍生物含量均高于未發酵組，其他類代謝物在兩組中的含量差別不明顯。同時，在鑒定出的63種差異性代謝物中，煙酸、肌氨酸在發酵22 h后表達量低于未發酵的枸杞汁。煙酸是人體必需的13種維生素之一，參與人體的脂質代謝、氧化過程和無氧分解過程[26]。肌氨酸在肌肉中以磷酸肌酸的形式存在，可促進ATP的合成[27]。其通過層次聚類分析可以看出，不同發酵階段對枸杞汁中各類代謝物的含量具有顯著影響，通過比較差異代謝物含量的異同，對鑒別經乳酸菌發酵后枸杞汁中的代謝產物具有一定的參考意義。

圖4 不同階段枸杞發酵液差異代謝物層次聚類熱圖Fig.4 Hierarchical clustering heat map of differential metabolites in goji juice fermented for different times

2.5 差異代謝物的代謝通路分析

植物在生長過程中是一個十分復雜的代謝過程，受多種物質和反應共同調控[28]，并不能僅僅從某一種物質含量的高低進行整體判斷，因此需進一步對其代謝通路進行分析。通過與KEGG數據庫比對，可將基因按照參與通路或行使功能進行分類，可以獲知代謝物參與的代謝通路信息，從而評價其對生物新陳代謝過程的影響。4個不同階段的枸杞發酵液中共檢索到差異代謝物參與的47 條代謝通路，KEGG二級分類名稱分別為氨基酸代謝、其他次生代謝產物的生物合成、氧化磷酸化、聚糖生物合成與代謝、脂質代謝、輔助因子和維生素的代謝、其他氨基酸代謝、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝、外源生物降解與代謝、碳代謝等。

將上述篩選鑒定的差異代謝物匹配信息后，利用對應物種的通路數據庫對其進行富集分析和拓撲結構分析，根據代謝通路的濃縮，識別出可能的受生物擾動的代謝通路[29]。首先，對差異代謝物和通路進行相關性分析，得到多條相關代謝通路。再根據P值和Impact值綜合分析，篩選出最為顯著的具體關鍵代謝通路有9 條，結果如表2所示。針對枸杞益生菌發酵過程中差異組分進行KEGG富集分析，分析發酵階段對益生菌發酵枸杞過程中代謝通路分析的影響，結果以氣泡圖的形式展現（圖5）。氣泡代表KEGG代謝通路，氣泡所在橫坐標和氣泡大小表示影響值，氣泡越大，表示通路重要性越大；縱坐標和氣泡顏色表示富集分析的P值（取負常用對數，即-lgP），顏色越深P值越小，富集程度越顯著。由圖5可知，既有合成途徑也有降解途徑，其中丙氨酸代謝處的氣泡顏色最深、氣泡相對較大，說明隨著發酵時間的延長，對乳酸菌發酵枸杞代謝中氨基酸類物質的影響最顯著。

表2 不同階段枸杞發酵液中代謝通路分析Table 2 Metabolic pathway analysis of goji juice fermented for different times

圖5 不同階段枸杞發酵液差異組分代謝通路影響因子圖Fig.5 Analysis of factors influencing the metabolic pathways of differential metabolites in goji juice fermented for different times

其次，通過KEGG等權威代謝物數據庫對差異代謝物進行映射，反映出具有極顯著差異的物質有10個，分別為丙氨酸、檸檬烯、苯甲醛、苯甲酸、煙酰胺、煙酸、角鯊烯、脯氨酸、肌氨酸、2-苯基乙酰胺。為了更直觀地了解關鍵代謝物，使用箱形圖比較來自4個不同階段枸杞發酵液中這10種物質的含量豐度差異（圖6）。其中丙氨酸、脯氨酸和肌氨酸主要參與氨基酸代謝，并且丙氨酸又參與氨酰tRNA生物合成途徑。氨基酸的代謝主要是由于菌株基于枸杞汁的代謝利用所導致，這些氨基酸為發酵枸杞汁提供了主要的風味。煙酰胺和煙酸主要參與輔助因子和維生素的代謝。而苯甲醛、苯甲酸主要為一些外源生物降解和代謝，二者同時參與氨基苯甲酸降解途徑和甲酸降解途徑，而苯甲酸又在苯丙氨酸代謝途徑中發揮作用；角鯊烯主要參與脂質代謝，是一種無毒性的具有防病治病作用的海洋生物活性物質，具有抗癌、抗腫瘤、抗氧化、減緩皮膚老化、增強機體免疫力等多種功效[30]；其他物質主要參與其他次生代謝產物的生物合成。同一代謝物同時參與了多條代謝通路，說明該差異代謝物對通路具有較大的影響。可見隨著發酵過程中營養物質的減少以及pH值的下降，各級代謝趨于穩定，代謝物也在不同的發酵時間之存在明顯差異。

圖6 不同階段枸杞發酵液中10種關鍵代謝物的相對豐度Fig.6 Relative abundance of 10 key metabolites in goji fermented for different times

3 結 論

基于GC-MS的非靶向代謝組學技術，從未發酵、接菌發酵0 h、接菌發酵10 h和接菌發酵22 h的4種枸杞發酵液中鑒定分析出63種差異代謝產物。通過對差異代謝物和通路進行相關性分析，篩選出了9 條最為顯著的關鍵代謝通路，映射出丙氨酸、脯氨酸、肌氨酸、2-苯基乙酰胺、檸檬烯、苯甲醛、苯甲酸、煙酰胺、煙酸、角鯊烯為關鍵代謝物。枸杞發酵液的差異代謝物中參與脂肪代謝途徑的有1種，參與輔助因子和維生素的代謝的有2種，參與外源生物降解和代謝的2種，而有參與氨基酸代謝的有3種，可見不同發酵階段可以調節枸杞中氨基酸類物質的代謝，顯著影響枸杞發酵產品特殊風味物質的形成。并且發現了具有增強機體免疫能力、抗衰老、抗腫瘤等多種生理功能的活性物質角鯊烯。該模型的建立可以有效對發酵過程中氨基酸、有機酸、糖類等生物活性物質含量變化進行區分，有助于探究外源添加物對枸杞的增效作用。同時為不同階段益生菌發酵產品建立了有效的評價方法，也為開發富含活菌和多種活性成分的枸杞發酵產品提供一定的理論參考。