酸筍中具有抗炎活性乳酸菌的篩選及鑒定

秦雅莉，趙笑潁，沈圓圓，于福田，劉小玲,2,*

（1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004；2.廣西水牛乳工程技術研究中心，廣西 南寧 530004）

酸筍是廣西及周邊地區的傳統發酵食品，歷史悠久，因其特殊氣味和風味深受本地人喜愛。酸筍是經過浸泡于山泉水或低鹽水，通過自然發酵后具有酸味的特色發酵食品。竹筍富含大量營養物質如游離氨基酸、蛋白質、糖[1]，是微生物生長的理想培養基。在以自然發酵為主的生產方式中，發酵酸筍品質變化的主要因素是微生物作用。乳酸菌作為自然發酵過程中主要的發酵微生物，其在發酵過程中的生長代謝不僅豐富了營養物質[2]，還參與特殊風味的形成[3]、抑制雜菌生長[4]，且改善人體腸道不適及增強結腸功能與穩定性，是篩選益生菌的來源之一[5]。

目前，針對酸筍的研究主要集中在營養成分與風味及加工工藝方面[1-3]，對其乳酸菌資源研究較少。有研究報道，酸筍發酵液中具有豐富的乳酸菌資源，優勢菌群主要集中于乳桿菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬和明串珠菌屬[6]，但國內外研究功能性乳酸菌主要來源于發酵乳制品、蔬菜制品、肉制品[7-9]，而酸筍作為一種以乳酸菌發酵為主的發酵蔬菜制品鮮有報道，特別是有關酸筍中具有良好抗炎活性的乳酸菌。乳酸菌是健康人群腸道微生物中的重要菌群，具有維持腸道微生態穩定[10]、增強機體免疫力[11]、修復受損屏障[12]、抑制致病菌過度繁殖以及預防治療炎癥等功效[12]；李少慧[7]從新疆奶酒與青海發酵酸奶中分離篩選得到乳酸桿菌M5-L與Q8-L，Zhou Xianrong等[14]從泡菜中篩選得到發酵乳桿菌CQPC04，Jin Junhua等[9]從發酵肉制品中得到植物乳桿菌Zhang-LL；以上研究均證實乳酸菌對腸道炎癥具有調節作用。

柳州螺螄粉風靡全國，酸筍作為其必不可少的配料之一，加速對酸筍資源深入研究和開發利用具有重要經濟價值，并有助于開發乳酸菌資源應用于本地特色功能性食品。因此本研究以廣西柳州酸筍發酵液為原料，采用傳統方法對乳酸菌進行分離純化，對乳酸菌的基本益生特性進行篩選和鑒定，最后初步評價該菌株的抗炎活性，以期進一步開發柳州本地酸筍中乳酸菌資源，為酸筍源乳酸菌應用于功能性食品的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸筍發酵液采集于柳州阿亮酸筍、之味螺食品科技公司以及柳州石山腳農業科技有限公司；對照菌株鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG由皇氏乳業集團提供；人結腸癌細胞系HT-29細胞株 生工生物工程（上海）股份有限公司；小鼠巨噬細胞RAW264.7中國科學院上海細胞庫。

MRS培養基 北京陸橋技術股份公司；牛膽鹽 青島海洋化工廠；一氧化氮（NO）測試盒（硝酸還原酶法） 南京建成生物工程研究所；白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6檢測試劑盒 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；胎牛血清 上海逍鵬生物科技公司；RPMI-1640培養基、高糖DMEM培養基美國Gibco公司；氯化鈉、氫氧化鈉、氯化鎂、碳酸銨、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉均為分析純。

1.2 儀器與設備

TC-512聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Biometra公司；凝膠成像系統 法國Vilber公司；GI80TW立式自動壓力蒸汽滅菌器 致微（廈門）儀器有限公司；DZKW-D-1電熱恒溫水浴鍋北京光明醫療儀器有限公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司；酶標儀 奧地利TECAN公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離純化

將酸筍發酵液以2%接種量接種于無菌MRS培養基中，于37 ℃恒溫培養箱中靜置富集培養24 h，取1.0 mL菌液用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，然后選擇合適的2～3個梯度，并分別取100 μL菌液涂布于MRS固體培養基，37 ℃恒溫培養48 h，觀察并記錄菌落顏色、形狀、光滑程度等特征[15]。挑取不同形態的單菌落劃線純化3次，對革蘭氏染色為紫色、接觸酶實驗為陰性的單菌落初步判定為乳酸菌，用50%甘油保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 耐酸性實驗

參考張娜[16]的方法，將實驗菌株于37 ℃培養箱中培養活化至3 代，以0.1%接種量接種于10 mL pH 3.0無菌MRS液體培養基中，置于37 ℃培養箱中培養24 h，以菌株在24 h與0 h的OD600nm之差ΔOD600nm為指標，進行初步耐酸菌株篩選。

1.3.3 耐膽鹽實驗

參考劉璐等[17]的方法并加以修改，將實驗菌株于37 ℃培養箱中培養活化至3 代，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，用無菌生理水洗滌菌液，并調節菌液濃度為1h109CFU/mL。以2%接種量接種于含0.1%牛膽鹽的MRS培養基中，分別取0 h和3 h菌液進行稀釋涂布測定活菌數，存活率按式（1）計算：

1.3.4 模擬人工胃腸液實驗

人工胃液的配制：氯化鉀0.514 395 g、磷酸二氫鉀0.108 872 g、碳酸氫鈉7.644 91 g、氯化鈉2.244 096 g、六水氯化鎂0.067 089 g、二水氯化鈣0.088 212 g、胰蛋白酶（1 500 U/mg）66.67 mg、牛膽酸鈉5.376 9 g、蒸餾水1 L，用1 mol/L HCl溶液調節pH值至3.0，用0.22 μm過濾器除菌備用。

人工腸液的配制：氯化鉀0.506 94 g、磷酸二氫鉀0.122 481 g、碳酸氫鈉2.100 25 g、氯化鈉2.758 368 g、六水氯化鎂0.024 396 g、碳酸銨0.048 045 g、二水氯化鈣0.022 053 g、胃蛋白酶（3 200 U/mg）625 mg、蒸餾水1 L，用1 mol/L HCl溶液調節pH值至7.0，用0.22 μm過濾器除菌備用。

參考Brodkorb等[18]方法并加以修改，將實驗菌株于37 ℃培養箱中培養活化至3 代，在4 ℃、4 000 r/min下離心10 min，用無菌生理鹽水洗滌菌液，并調節菌液濃度為1h109CFU/mL。取1 mL菌液于9 mL人工胃液中，37 ℃、90 r/min培養2 h，利用平板計數法分別測定0、2 h活菌數。按式（2）計算存活率：

取上述模擬消化后的溶液1 mL于9 mL人工腸液中，37 ℃、90 r/min培養2 h，利用平板計數法分別測定0、2 h活菌數，按式（3）計算存活率：

1.3.5 黏附實驗

參考Celebioglu等[19]方法并加以修改，采用熒光標記法。取50 mL已活化菌液，在4 000hg、4 ℃離心10 min，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3次，并調整菌液濃度OD600nm為0.5f0.05。在37 ℃用100 mmol/L 5(6)-羧熒光素二乙酸酯染色30 min，PBS洗滌2次，用RPMI-1640培養基重懸，以激發波長485 nm、發射波長538 nm于酶標儀下測定熒光強度。

HT-29細胞經胰酶消化后，利用血球計數板進行細胞計數，并稀釋調節細胞濃度至2.5h105cells/mL，均勻接種于24 孔板，每孔500 μL。37 ℃、5% CO2培養箱中培養至融合態，加入500 μL上述已熒光標記的菌懸液，同時用鼠李糖乳桿菌LGG作對照，37 ℃培養1 h后，PBS洗滌3次，加入500 μL含1 g/100 mL SDS的0.1 mol/L NaOH溶液溶解黏附的乳酸菌，以激發波長485 nm、發射波長538 nm測定熒光強度。細胞黏附率按式（4）計算：

1.3.6 細胞活力檢測

參考Zhao Xiaohong等[20]方法并加以修改。將胰酶消化后的RAW264.7細胞濃度調整到5.0h104cell/mL，均勻接種于96 孔板，37 ℃、5% CO2培養箱中培養至融合態。加入10 μL濃度為1.0h108CFU/mL菌液孵育3 h，同時用鼠李糖乳桿菌LGG作對照孔，以未加菌液為空白孔，加入10 μL CCK-8試劑，孵育1 h后，測定每孔OD450nm。存活率按式（5）計算：

1.3.7 NO釋放水平測定

參考Emam等[21]方法并加以修改。將胰酶消化后的RAW264.7細胞懸液，通過血細胞計數法將濃度調整為2.5h105cells/mL，均勻接種于24 孔板，37 ℃、5% CO2培養箱中培養至融合態。加入1 μg/mL脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激24 h，然后加入50 μL已活化濃度為1h108CFU/mL的菌液培養3 h，收集上清液。根據NO檢測試劑盒說明書操作，按式（6）計算NO濃度。同時用鼠李糖乳桿菌LGG作陽性對照，以未處理正常細胞作空白。

式中：c為亞硝酸鈉標準溶液濃度，20 μmol/L；n為稀釋倍數（n=4）。

1.3.8 IL-6、IL-1β細胞因子水平測定

按1.3.7節方法進行處理得到上清液，然后按照試劑盒說明書測定上清液中炎癥因子IL-6、IL-1β水平。

1.3.9 16 S rRNA基因序列分析

菌株活化至3 代后，于MRS固體培養基劃線培養48 h，挑取單菌落進行PCR。16S rRNA基因采用反向引物1492R（5’-AGAGTTTGA TTTGATCCTGGCTAG-3’）、正向引物27F（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進行擴增，以25 μL反應體系，94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min、64 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃末端延伸10 min，4 ℃保存。擴增結束后取4 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，測序，測序結果在NCBI的GenBank序列數據庫進行BLAST分析，在基因庫選取參考菌株進行同源性比較，鑒定到種。選取適宜的參考菌株序列，采用MEGA 7.0軟件進行構建系統發育樹[22]。

1.4 數據處理與統計分析

2 結果與分析

2.1 酸筍發酵液中乳酸菌的分離純化

根據革蘭氏染色為紫色和接觸酶實驗為陰性，從3 份樣品中共篩選得到46 株疑似乳酸菌，均為乳白色單菌落，呈桿狀或短桿狀，并且伴有酸味。乳酸菌SS-31菌落形態與革蘭氏染色圖如圖1所示。

圖1 乳酸菌SS-31菌落（A）與革蘭氏染色鏡檢形態（B）Fig.1 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of strain SS-31

2.2 酸筍發酵液中乳酸菌的耐酸能力

表146 株分離菌株在pH 3.0 MRS培養基中24 h的生長情況Table 1 Growth status of isolated strains cultured for 24 hours in MRS medium at pH 3.0

益生菌發揮益生作用的前提是存活于人體胃腸道中，需具有一定耐酸、堿能力。胃液酸性環境中胃蛋白酶原被激活，殺死隨食物進入胃內的微生物[23]。從表1可以看出，菌株SS-4、SS-10、SS-13、SS-14、SS-17、SS-20、SS-21、SS-22、SS-28、SS-30、SS-31、SS-33、SS-37、SS-42、SS-44、SS-45 ΔOD600nm為0.20～0.44，表現出較強耐酸能力。這是由于乳酸菌在生長代謝過程中產生各種有機酸，使其環境pH值降低，具有較強耐受能力。竇芳嬌等[24]從福建長桿白菜泡菜中篩選得到的植物乳桿菌RPC21、鼠李糖乳桿菌RCQ4在pH 2.5環境下培養18 h的ΔOD600nm分別為0.075、0.025，說明本實驗篩選得到的乳酸菌具有較強的耐酸能力，在胃部低pH值環境下具有一定生存能力。

2.3 酸筍發酵液中乳酸菌的耐膽鹽能力

人體小腸中的膽鹽濃度一般為0.03%～0.3%。膽鹽耐受能力也是衡量優良菌株的重要指標[25]。由表2可以看出，上述篩選得出的耐酸菌株在含0.1%牛膽鹽MRS培養基中的存活率為8.64%～139.77%，所有菌株活菌數均在106CFU/mL以上，其中存活率達80%以上的菌株為SS-10、SS-14、SS-17、SS-31、SS-32、SS-37、SS-44、SS-45，表現出較高的膽鹽耐受性。據報道植物乳桿菌200655和KCTC 3108也具有較高的膽鹽耐受水平，在0.3%牛膽鹽MRS培養基中培養24 h后的存活率分別為102.48%和100.76%[26]。有研究表明，膽鹽通過破壞細菌細胞膜的完整性導致細胞死亡，細胞膜中的多種脂質對菌株的膽鹽耐受能力具有影響[27]。

表2 乳酸菌的耐膽鹽能力Table 2 Bile salt tolerance of the tested strains

2.4 酸筍發酵液中乳酸菌的耐胃腸道消化能力

胃腸道消化環境復雜，含胃蛋白酶、胰蛋白酶等，能夠分解菌體蛋白質，抑制甚至殺死外來微生物。對耐酸、耐膽鹽能力較強的8 株乳酸菌通過連續培養方式進行模擬胃腸道消化實驗。由表3可以看出，經過2 h人工胃液消化后，所有菌株活菌數均呈下降趨勢，但活菌數均保持在107CFU/mL以上，存活率在65%以上，其中SS-32、SS-37、SS-45菌株存活率超過85%，SS-37存活率高達90.59%，表現出較強的耐受能力。

表3 乳酸菌在人工胃液中的耐受性Table 3 Tolerance of LAB in artificial gastric juice

相比于人工胃液消化，人工腸液消化影響更為顯著（表4），經過2 h腸液處理后，所有菌株活菌數均較大程度降低，存活率為0.56%～36.67%。SS-17菌株表現出較高的腸道消化耐受能力，而SS-14、SS-37、SS-44存活率均不超過1%。綜合分析，篩選得到SS-10、SS-17、SS-31、SS-32、SS-45 5 株菌進入后續實驗。

表4 乳酸菌在人工腸液中的耐受性Table 4 Tolerance of LAB in artificial intestinal fluid

不同來源及種類的乳酸菌對胃酸和膽鹽的耐受能力不同。杜蘭蘭等[28]發現類植物乳桿菌L-ZS9經模擬胃腸道消化后，活菌數由109CFU/mL降低至107CFU/mL，而本實驗研究中SS-17活菌數由108CFU/mL降低至106CFU/mL。有研究通過細菌微膠囊化保證通過胃腸道過程中的菌體完整性，從而保持其益生活性，充分發揮益生特性[29]。

2.5 乳酸菌的黏附能力分析

益生菌通過黏附腸道細胞定植，競爭性地抑制致病菌與腸壁黏附，從而調節腸道菌群和發揮益生特性[19,30]。由圖2可知，不同菌株對HT-29細胞的黏附率在2.21%～4.95%之間，其中SS-45黏附率（4.69%）最高，與鼠李糖乳桿菌LGG（4.95%）無顯著差異（P＞0.05），其次是SS-31（4.47%）。據報道，短乳桿菌KU15153、植物乳桿菌Ln1、短乳桿菌B13-2對HT-29細胞黏附率分別為5.62%、2.69%、6.11%[31-33]。因此選擇SS-17、SS-31、SS-45進行后續實驗。

圖2 乳酸菌對HT-29細胞的黏附作用Fig.2 Adhesion of LAB to HT-29 cells

2.6 乳酸菌對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞釋放NO的抑制作用

抑制NO釋放是治療多種炎癥性疾病的重要途徑。由圖3可知，所測菌株在濃度1.0h108CFU/mL時均對RAW264.7細胞無毒性作用，且均能抑制LPS誘導RAW264.7巨噬細胞中NO的產生。陽性對照LGG組NO濃度為7.35 μmol/L，LPS組NO濃度為41.49 μmol/L，與模型組相比，SS-17、SS-31、SS-45組NO濃度分別為11.50、6.11、13.44 μmol/L，表明這3 株菌株均能顯著下調LPS誘導RAW264.7巨噬細胞的NO釋放量。與LGG相比，菌株SS-31治療效果更顯著（P＜0.05）。據報道，從新疆奶酒與青海發酵酸奶中分離篩選得到的乳酸桿菌M5-L與Q8-L對LPS誘導HT-29細胞具有抗炎效果；M5-L與Q8-L活菌體及滅活菌體作用均能顯著降低NO分泌水平，其原因可能是活菌體與滅活菌體與LPS結合，導致誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）不能被激活[34]。LPS是革蘭氏陰性菌的主要致病成分。當機體受到多種細胞因子或LPS等刺激時，核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）活化，NF-κB抑制因子（inhibitor of NF-κB，IκB）激酶被激活，IκBα/β磷酸化，磷酸化IκB進一步被泛素化，然后被蛋白酶降解，使NF-κB從NF-κB-IκBs復合物中解離并轉位入細胞核中進行轉錄翻譯，釋放促炎因子及次級炎癥介質，從而導致炎癥惡性循環，加重炎癥反應[35]。

圖3 乳酸菌對RAW264.7細胞的細胞毒性（A）及其對LPS誘導釋放NO的影響（B）Fig.3 Effect of LAB on the survival rate (A) and NO secretion level (B) of LPS-treated RAW264.7 cells

2.7 SS-31對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞釋放炎癥因子的抑制作用

為進一步研究菌株SS-31對LPS誘導RAW264.7細胞免疫應答的干預作用，本實驗檢測LPS誘導RAW264.7細胞上清液中炎癥因子水平。

如圖4所示，LPS誘導RAW264.7細胞分泌大量促炎因子IL-1β和IL-6，乳酸菌SS-31能夠顯著抑制IL-1β、IL-6分泌（P＜0.05），抑制率分別為49.21%、14.12%，且SS-31對IL-1β的抑制效果優于對照組LGG（20.40%），但對IL-6的抑制效果與LGG（13.79%）無顯著差異。據報道，發酵乳桿菌CQPC04能有效緩解葡聚糖硫酸鈉誘導小鼠結腸炎癥狀，抑制促炎因子IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）和IL-12的釋放，增加血清中抗炎因子IL-10的釋放[14]，這與本實驗研究結果一致。

圖4 乳酸菌SS-31對RAW264.7細胞分泌炎癥因子的調節作用Fig.4 Regulation of strain SS-31 on the secretion of inflammatory factors in RAW264.7 cells

2.8 SS-31的16S rRNA基因序列分析

如圖5所示，SS-31與Lactobacillus fermentum親緣性最高，同源性在99%以上，且序列相似性達100%。同時菌株SS-17、SS-45經鑒定也均為L.fermentum，相似性均達100%。

圖5 基于16S rRNA 基因序列的乳酸菌系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain SS-31 based on 16S rRNA gene sequence

宿主免疫系統第一道防線的中心為巨噬細胞和單核細胞，乳酸菌可刺激巨噬細胞誘導相關細胞因子產生，調節細胞內信號轉導，從而調節炎癥反應。李川[11]建立2,4,6-三硝基苯磺酸誘導結腸炎小鼠模型發現，從泡菜中篩選得到的植物乳桿菌NCU116通過調整腸道菌群平衡，預防氧化應激對腸道損傷，調節IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ的釋放緩解炎癥作用。Zhou Xianrong等[14]發現發酵乳桿菌CQPC04下調促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6和iNOS的表達，上調促炎因子IL-10，通過抑制NF-κB信號通路從而緩解炎癥。Jin Junhua等[9]發現活和熱滅活植物乳桿菌Zhang-LL通過保護腸道屏障通透性，維持腸道菌群穩定性減輕大鼠潰瘍性結腸炎癥狀。此外，雙歧桿菌BCM、嗜酸乳桿菌LCM[36]也均具有抗炎活性。由于不同地區、來源的乳酸菌所處環境不同，且同屬不同種菌株間也存在特異性，所發揮益生特性也不盡相同，因此從酸筍發酵液篩選得到的發酵乳桿菌SS-31的具體抗炎機制還需進一步探究。

3 結 論

發酵食品中乳酸菌資源豐富，安全性高，廣泛應用于食品行業，但酸筍發酵液中的乳酸菌資源報道較少。本研究結合傳統乳酸菌分離鑒定方法，從柳州采集的3 份酸筍發酵液中共篩選得到46 株革蘭氏染色陽性、接觸酶陰性的疑似乳酸菌。耐酸、耐膽鹽、耐胃腸道以及黏附性實驗結果顯示，菌株SS-17、SS-31、SS-45在腸道內具有較強存活能力，充分保證了乳酸菌在腸道內定植并發揮益生作用。通過LPS刺激RAW264.7細胞建立炎癥模型，3 株菌均不同程度降低細胞上清液中NO水平，但菌株SS-31效果更為顯著，且與模型組相比，顯著下調促炎因子IL-6、IL-1β水平，并通過16S rRNA測序鑒定為發酵乳桿菌。但其免疫調節的作用機制尚未明確，有待深入研究。本實驗結果表明酸筍發酵液可作為篩選具有益生活性乳酸菌的優良來源，發酵乳桿菌SS-31具有作為益生菌的潛力，為后續開發具有廣西特色發酵食品提供了菌株資源和理論基礎。