9 種中藥單體對艱難梭菌的體外抑菌活性研究*

楊 景，陳向東，汪 輝，強俊磊，田宇航

中國藥科大學 生命科學與技術學院微生物學教研室，南京 211198

艱難梭菌是一種專性厭氧、革蘭陽性、梭狀芽孢桿菌[1]。該菌主要通過毒素介導，導致分泌性腹瀉，致使腸壁出現炎癥、黏膜出血壞死，甚至形成假膜性炎癥[2]。目前，臨床上治療艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）應用最廣泛地是抗生素，普遍使用的是萬古霉素（VAN）、非達霉素[3]以及替換藥甲硝唑[4]。但隨著抗生素的廣泛應用，艱難梭菌耐藥性逐漸增強，人體腸道菌群失調，導致CDI 的發病率及致死率不斷增高，成為院內感染腹瀉的主要原因[5]。因此尋找新的治療方案尤為重要。

本研究對國內近20 年有關治療胃腸道疾病的中藥單體的文獻報道進行調研，選取資源豐富、無副作用、溶解性較好、具有抑菌活性的9 種中藥單體，探究其對艱難梭菌的體外抑菌活性，旨在為中藥單體治療CDI 提供依據。

1 材 料

1.1 菌株

50 株艱難梭菌臨床分離株，由中國疾病預防控制中心提供。標準菌株：艱難梭菌（Clostridium difficile ATCC 43593），脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis ATCC 25285）由北京百歐博偉生物技術公司提供。

1.2 藥品和試劑

黃芩素、槲皮素、姜黃素、大黃素、原花青素、黃芪多糖、二氫楊梅素（瑞迪生物公司）；沒食子酸（科密歐化學試劑公司）；鞣花酸（圣青生物公司）；萬古霉素、替硝唑（上海源葉生物公司）；CCFA 瓊脂基礎、腦心浸液肉湯、腦心浸液瓊脂、布氏肉湯、布氏瓊脂（青島海博公司）；DMSO（國藥集團化學試劑公司）。

1.3 儀器設備

厭氧培養箱（Thermo）；多點接種儀（日本佐久間SAKUMA）；潔凈工作臺（吳江凈化設備總廠）；GHX-9080B 恒溫培養箱（上海福瑪實驗設備公司）。

2 方 法

2.1 對艱難梭菌有抑菌活性的中藥單體的初篩

采用濾紙片法測定9 種中藥單體對艱難梭菌的抑菌活性。稱取適量黃芩素、槲皮素、姜黃素、大黃素、鞣花酸溶解于含5% DMSO 的BHI 培養基中。將沒食子酸、原花青素、二氫楊梅素、黃芪多糖溶解在BHI 中，配制成濃度為10 mg·mL-1的溶液。同時設置VAN 和溶劑對照組。將6 mm 無菌濾紙片浸入溶液中6～8 h，備用。

選取活化的艱難梭菌單菌落，接種于BHI 培養基，37℃厭氧培養24～48h，調整菌濃度為1×106CFU·mL-1。將含藥濾紙片貼在涂布有艱難梭菌菌懸液的BHI 平板表面，37℃厭氧培養24～48h，測量抑菌圈。

2.2 最低抑菌濃度（MIC）測定

參照CLSI 推薦的《厭氧菌藥物敏感性試驗方法（M11-A7）》，以瓊脂稀釋法測定“2.1”中抑菌圈較大的中藥單體，對50 株艱難梭菌臨床分離株的MIC，以VAN、替硝唑為標準品。倍比稀釋配制0.02～20mg·mL-1的中藥單體溶液，取不同濃度的藥液1.5 mL 與含有5%無菌脫纖維羊血的強化布氏瓊脂培養基，立即混勻，倒入無菌培養皿中，制備含藥平板，同時制備不含藥液的空白平板。選取活化的艱難梭菌單菌落，配制成0.5 麥氏濁度的菌懸液，用多點接種儀將50 株艱難梭菌臨床分離株和質控菌的菌懸液接種到含藥平板上，37 ℃厭氧培養24～48 h，設置需氧對照，藥敏結果的判讀參照CLSI 的M11-A7。

2.3 最低殺菌濃度（MBC）測定

采用微量肉湯稀釋法測定抑菌活性較好的中藥單體對艱難梭菌的MBC。在96 孔板中進行微量稀釋測定，先加入不同濃度的中藥單體或VAN，然后加入菌懸液，使得中藥單體的最終濃度為0.002～2 mg·mL-1，VAN 的終濃度為0.03125～32 μg·mL-1，菌懸液和含5% DMSO 的BHI 培養基作對照。37 ℃厭氧培養24～48 h，以肉眼可見澄清的藥物的最低濃度為MIC。從未變渾濁的孔中吸取培養物加入培養皿內，再倒入已融化并冷卻至45 ℃～50 ℃的BHI瓊脂培養基，混合均勻，待冷凝后將培養皿翻轉，于37 ℃厭氧培養24～48 h，以菌落數不超過5 個的平板所對應的孔的最低藥物濃度即為MBC。

2.4 pH 穩定性測定

采用濾紙片法測定pH 對抑菌活性較好的中藥單體抑菌活性的影響。將DMSO 與磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液相混合，配成緩沖溶液，分別配制不同pH 值（3、4、5、6、7、8）、濃度為10 mg·mL-1的中藥單體溶液，設置VAN 和溶劑對照組，將6 mm 無菌濾紙片浸入溶液中6～8 h，備用。將含藥濾紙片貼在涂布有艱難梭菌菌懸液的BHI 平板表面，37 ℃厭氧培養24～48 h，測量抑菌圈。

2.5 中藥單體與萬古霉素聯合抑菌實驗

采用微量肉湯稀釋法測定抑菌活性較好的中藥單體與VAN 的聯合抑菌作用。選取8×8 棋盤法混合制備抗菌藥物混合液，VAN 的終濃度為0.0078～1μg·mL-1，中藥單體的終濃度為0.01～2.5mg·mL-1，隨后加入艱難梭菌菌懸液，37 ℃厭氧培養24～48 h。同時設置菌懸液和溶劑對照，每個濃度設置3組平行，聯合用藥結果用部分抑菌濃度指數（FIC index）判定。

3 結果

3.1 對艱難梭菌有抑菌活性的中藥單體的初篩

濾紙片法結果顯示，濃度為10mg·mL-1的9 種中藥單體對艱難梭菌具有不同程度的抑制作用，其中黃芩素、槲皮素的抑菌圈較大，效果較好，見圖1。它們的抑菌圈直徑分別為（16.12±0.50）mm、（12.47±0.89）mm。

圖1 黃芩素、槲皮素對艱難梭菌的抑菌效果（濾紙片法）

3.2 MIC 和MBC 測定

黃芩素、槲皮素對艱難梭菌的MIC 和MBC 測定結果見表1。兩者的抑菌活性較好。

表1 黃芩素、槲皮素對艱難梭菌的MIC、MBC（mg·mL-1）

3.3 pH 穩定性測定

由圖2 所示，pH 在3～8 變化對黃芩素、槲皮素的抑菌活性無明顯影響，表明有良好的pH 穩定性。

圖2 不同pH 對黃芩素、槲皮素抑菌活性的影響

3.4 兩個中藥單體與萬古霉素聯合抑菌實驗

黃芩素、槲皮素與VAN 的聯合抑菌結果見表2。FIC index≤0.5，即黃芩素、槲皮素與VAN 之間都有協同作用，在聯合用藥中，黃芩素、槲皮素的MIC 值分別為單獨用藥的1/8、1/64 倍。

表2 黃芩素、槲皮素與VAN 的聯合抑菌結果（MIC 值，mg·mL-1）

4 討論

許多中藥都有抑菌殺菌的作用，其有效成分多為揮發油、黃酮類、有機酸、多糖類、蒽醌和生物堿等，上述化合物已經被證實對耐藥菌具有一定的抑制作用[6]。中藥對腸道疾病也有良好的治療潛力，可以調節腸道菌群和胃腸代謝水平，恢復腸道正常功能，起到益生元的作用，這與其中發揮作用的一些中藥單體成分密切相關，對這些中藥單體進行研究，對CDI 的治療具有很大的意義。研究表明，黃芩素、槲皮素等抗菌譜較廣，對金黃色葡萄球菌[7]、沙門氏菌、大腸埃希菌[8]等有較強的抗菌作用，還可以恢復腸道菌群的平衡、治療胃腸道炎癥[9]。黃芩素對金黃色葡萄球、大腸埃希菌的MIC 值分別為12.8～25.6、12.8～64.0 mg·mL-1。2～6 mg·L-1的黃芩素與慶大霉素體外可以協同抗耐萬古霉素的腸球菌。槲皮素對MRSA、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的MIC值分別為0.6 mg·mL-1、0.0061、0.0242 μmol·mL-1，對腸球菌體外增殖均表現為強烈的抑制作用。

本實驗研究黃芩素等9 種中藥單體對50 株艱難梭菌的體外抑菌活性，對篩選出的抑菌活性較好的黃芩素、槲皮素的MIC、MBC 進行測定，黃芩素、槲皮素的MIC 分別為1.25、2.5 mg·mL-1，MBC 分別為1.25、5 mg·mL-1；在pH 3～8 下，抑菌活性沒有明顯變化，具有pH 穩定性；兩者與VAN 聯合使用具有協同作用。因此，黃芩素、槲皮素對艱難梭菌有良好的體外抑菌活性，可以與VAN 聯合應用提高抑菌效果。

黃芩、柴胡具有悠久的歷史、安全性高，黃芩素、槲皮素是其主要的有效成分，今后對黃芩素、槲皮素體內抑菌活性及相關機制開展進一步研究，為治療CDI 提供更真切的選擇。