HPLC 法同時測定不同來源紅曲中腺苷等3 個成分的含量*

高文銘，林躍松，戴國梁，趙林鋼**

1 南京市六合區中醫院，南京 211505；2 南京中醫藥大學附屬醫院，南京 210029

紅曲是一種藥、食兩用的傳統物質，性溫、味甘，具有活血化瘀、健脾消食之功效，臨床主治高脂血癥、產后惡露不凈、動脈粥樣硬化、瘀滯腹痛等癥[1]。

曲霉科真菌紫色紅曲菌Monascus purpureus Went 的菌絲及孢子在粳米內部生長，使整個米粒變成紅色，即為紅曲[2]。現代藥理研究表明，紅曲具有降血脂、降血壓、抗腫瘤等作用[1，2]。他汀同系物及核苷類成分是紅曲中的主要活性成分[3]。

目前，紅曲現有的質量標準主要以洛伐他汀的含量作為參考[4]。此外，核苷類成分亦具有多種生物學活性，參與DNA 代謝過程，并具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒等作用[5]。免疫細胞具有更新代謝迅速的特點，在內源性核苷酸無法滿足生理需求時，通過外源性核苷酸的補充，特別是藥物及膳食內的核苷酸，也可參與到機體的免疫調節[6]中。其中，腺苷、腺嘌呤具有降壓、降低心率、鎮靜抗驚厥等作用[6]。基于中藥具有多成分、多靶點的特性，單一指標性成分不能全面反映中藥的質量，因此中藥質量標準“將從單指標向多指標、從指標性成分向藥效成分控制”方向發展。本研究將對紅曲中洛伐他汀及腺苷、腺嘌呤進行定量分析，為紅曲質量控制提供數據支持。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀（配有G1311A四元泵、G1313A 自動進樣器、G1316A 柱溫箱、G1314A 檢測器及Chemstation（A.10.02）工作站）；AT-201 電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；Biofuge PrimoR 冷凍高速離心機（德國Heraeus 公司）；MIX-2500 混合儀（杭州佑寧儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

對照品：洛伐他汀（批號：100600-202006，純度99.6%）、腺苷（批號：110879-201703，純度99.7%）、腺嘌呤（批號：110886-201102，純度99.4%）均購于中國食品藥品檢定研究院；酒用紅曲（批號：210126001、210126002、210126008)、食用紅曲（批號：210126003、210126004、210126007）均購自武漢佳成生物制品公司；藥用紅曲（批號：180914、190513、200612）購自桐君堂中藥飲片公司；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純；其他試劑為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6mm×150mm，5 μm）；流動相：A 為乙腈，B 為0.1%磷酸，梯度洗脫，見表1；柱溫：40 ℃；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液的配制

分別稱取腺苷、腺嘌呤及洛伐他汀對照品適量，精密稱定，加入50%甲醇溶液溶解，配制成含腺苷6.40 μg·mL-1、腺嘌呤12.80 μg·mL-1、洛伐他汀64.00 μg·mL-1的混合對照品溶液。依次進行倍比稀釋，結果見表2。

表2 3 種成分的濃度信息（μg·mL-1）

2.3 供試品溶液的制備

取本品約0.1 g，精密稱定，加入50%甲醇，定容至10mL，超聲處理15min，搖勻，4℃條件下12000 r·min-1離心10 min，精密吸取上清液1 mL，置10 mL量瓶中，50%甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

2.4 系統適用性

取混合對照品溶液及供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，結果顯示，腺苷、腺嘌呤及洛伐他汀3 個成分理論塔板數均大于5000，分離度大于1.5。對照品溶液和供試品溶液的色譜圖見圖1。

圖1 空白溶劑（A）、對照品（B）、藥用紅曲（C）、食用紅曲（D）及酒用紅曲（E）的色譜圖

2.5 線性關系考察

精密吸取“2.2”項下系列混合對照品溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，以峰面積（Y）為縱坐標，濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，計算標準曲線。結果表明，腺苷、腺嘌呤及洛伐他汀的質量濃度在相應范圍內與峰面積呈良好線性關系。見表3。

表3 3 種成分的線性方程、相關系數及線性范圍

2.6 穩定性試驗

取藥用紅曲樣品（批號：180914），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫放置于自動進樣器中，當放置0、4、8、12、24 h 時，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積。結果顯示，腺苷、腺嘌呤、洛伐他汀峰面積的RSD 分別為0.9%、1.1%、0.6%（n=5），表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

取藥用紅曲樣品（批號：180914），共6 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果表明，腺苷、腺嘌呤、洛伐他汀含量的RSD 分別為0.8%、0.9%、0.5%（n=6），表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一批藥用紅曲樣品（批號：180914）0.050 g，分別精密加入各對照品溶液適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，計算峰面積，根據標準曲線線性方程計算加樣回收率。結果腺苷、腺嘌呤、洛伐他汀的平均回收率（n=6）分別為99.29%、101.64%、98.87%；其對應的RSD 分別為3.45%、4.41%、3.25%。

2.9 樣品含量測定

分別取3 批不同來源的紅曲，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行制備3 份，按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，計算各批號的紅曲中腺苷、腺嘌呤、洛伐他汀的平均含量。見表4。

表4 不同來源的紅曲中3 種成分含量測定結果（n=3，mg·g-1）

3 討論

本研究選用十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相。綜合文獻資料[7，8]，試驗了如下幾種流動相體系：甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸，結果發現，使用乙腈-0.1%磷酸作為流動相進行梯度洗脫，腺苷、腺嘌呤、洛伐他汀的峰形良好，分離度高，紅曲中其他化合物對上述3種成分無干擾。此外，對腺苷、腺嘌呤、洛伐他汀在波長200～400 nm 進樣掃描，結果發現，上述3 種成分的最佳吸收波長分別為260、260、238 nm，綜合考慮各成分在紅曲中的含量及對不同波長的敏感度，最終選擇254 nm 作為檢測波長。

紅曲的前處理方法主要有超聲提取法、柱層析法、回流提取法等，為了使操作步驟簡化，所以選擇直接超聲提取法。還對超聲時間、提取溶劑的種類（甲醇、乙腈、乙醇等）及其比例進行了考察，結果顯示，超聲10 min 時測得含量與15 min 時基本一致，超聲至40 min 時含量無變化，為保證提取完全，確定超聲時間為15 min，以50%甲醇的提取效率較高。

從含量測定結果看出，不同來源紅曲中腺苷、腺嘌呤、洛伐他汀的含量均有一定的差異。其中，藥用紅曲在腺苷、腺嘌呤、洛伐他汀含量上明顯高于其他兩種紅曲；食用紅曲與酒用紅曲在腺苷、腺嘌呤含量上差異較小，但洛伐他汀含量高于酒用紅曲。

目前，紅曲藥材還未有“國家標準”，紅曲的“地方標準”亦不統一，且多以顯微鑒別和水分控制為主，難以合理引導國內紅曲產業的規范化發展。紅曲屬于發酵產品，其發酵菌株、發酵方式、發酵時間、培養基質、pH 等因素均會影響紅曲的產物種類和含量[9]。對此，建立中藥紅曲的質量標準是十分迫切和必要的。