稚兒靈顆粒HPLC 指紋圖譜及多指標成分的含量測定

李 佳，王 玉，金 華

淮安市食品藥品檢驗所，淮安 223300

稚兒靈顆粒是一種復方中成藥，由著名的古方參苓白術散、歸脾湯、八珍湯合方化裁而成，該制劑由黨參、太子參、南沙參、白術（麩炒）、白芍（麩炒）、制何首烏、木香、陳皮、甘草等24 味中藥材組成；方中諸藥合用，全方共奏益氣健脾、補腦強身之功效[1]。用于小兒厭食，面黃體弱，夜寢不寧，睡后盜汗等癥，且在治療遷延性腹瀉上取得滿意療效。稚兒靈顆粒作為兒科臨床常用藥物，目前對其化學成分的研究報道很少，江曉等[2]曾研究稚兒靈顆粒質量標準；但僅對橙皮苷單一成分進行了分析。

由于稚兒靈顆粒為復方制劑，成分復雜，單一測定某種成分的含量，不足已綜合反映其整體質量。而目前指紋圖譜技術是一種多組分復雜樣品的質量控制方法，可以反映出待測樣品的特征性和整體性[3，4]，被國內外廣泛接受和采納，可以作為質量控制和藥物評價的手段之一[5,6]。

目前關于稚兒靈顆粒的指紋圖譜研究尚未見報道，據此，對稚兒靈顆粒開展HPLC 指紋圖譜研究[7,8]，對5 個廠家的19 批樣品進行相似度分析，并對其共有峰進行來源歸屬和化學成分的指認，同時測定其中4 種有效成分的含量，為稚兒靈顆粒的系統評價和質量控制提供試驗依據。

1 材 料

1.1 儀器

UltiMate3000 高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器）；Aglient 1260 高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器）；XS205DU 十萬分之一分析天平；KH7200DE 型數控超聲波清洗器。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 對照品沒食子酸（批號：110831-201605，質量分數90.8%）﹑芍藥苷（批號：110736-201337，質量分數94.9%）﹑橙皮苷（批號：110721-201318，質量分數95.3%）﹑甘草苷（批號：111610-201908，質量分數95.0%）均購自于中國食品藥品檢定研究院；芍藥內酯苷（39011-90-0,質量分數98.0%）購自于上海標準技術中心。

1.2.2 供試品見表1。

表1 樣品信息

1.2.3 試劑乙腈﹑甲醇為色譜純；乙醇為分析純；磷酸為分析純；水為超純水。

1.3 藥材飲片

白芍（麩炒）﹑陳皮﹑木香﹑甘草（蜜炙）均為市售藥材，經本所中藥室鑒定品種正確。

2 方法與結果

2.1 本品指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL。流動相A 為乙腈，流動相B 為0.05%磷酸溶液，梯度洗脫程序：0～10min，1%A，99%B；10～35 min，1%～24%A，99%～76%B；35～45min，24%～38%A，76%～62%B；45～50min，38%～1%A，62%～99%B。

2.1.2 混合對照品溶液制備分別精密稱取沒食子酸對照品10.66 mg、芍藥苷對照品20.38 mg﹑芍藥內酯苷對照品9.89 mg﹑橙皮苷對照品18.04 mg﹑甘草苷對照品10.26 mg，分別置于10 mL 量瓶中，作為各對照品貯備液；分別精密吸取上述各儲備液各1 mL，置于同一50 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備取本品1 袋，研細，精密稱取粉末6 g，置具塞三角瓶中，加入稀乙醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲振蕩處理（700 W，40 kHz）45 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.1.4 單味藥材溶液制備分別稱取白芍（麩炒）、陳皮、木香、甘草（蜜炙）藥材適量，按“2.1.3”項下方法制成單味藥材溶液。

2.1.5 陰性對照溶液制備精密稱取缺白芍（麩炒）、陳皮、木香、甘草（蜜炙）的樣品，照“2.1.3”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.1.6 參照峰的選擇在稚兒靈顆粒指紋圖譜中，芍藥苷峰和橙皮苷峰大小適中且穩定，與相鄰峰達到完全分離，對稱性較好；但由于橙皮苷出峰時間較晚，位于整個色譜圖的后半部，故考慮選擇芍藥苷峰為參照峰。在以下方法學考察中均以各供試品溶液色譜圖中芍藥苷峰的保留時間和峰面積值為參照，計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.1.7 精密度試驗取稚兒靈顆粒S1 號樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6 次，記錄60 min 的色譜圖。以芍藥苷峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間，RSD均小于2.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復性試驗取稚兒靈顆粒S1 號樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液6 份，以芍藥苷峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間，RSD 均小于2.0%（n=6），表明該方法的重復性良好。

2.1.9 穩定性試驗取稚兒靈顆粒S1 號樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液6 份，按“2.1.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣檢測，分別記錄60 min 的色譜圖。以芍藥苷峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間，RSD 均小于2.0%（n=6）,表明該供試品溶液在24 h 內穩定。

2.1.10 指紋圖譜的建立及相似度計算取19 批稚兒靈顆粒，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄60 min 的色譜圖。采用 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”2012 版（國家藥典委員會），以S1 為參照譜，采用多點校正后進行Mark 峰匹配，生成指紋圖譜共有模式，根據匹配結果共標定了10 個峰，得到19 批稚兒靈顆粒的HPLC 指紋圖譜及對照指紋圖譜，標記為S1～S19，見圖1、圖2。同時對19 批樣品的指紋圖譜進行相似度評價計算，結果S1～S19 的相似度均大于0.90。

圖1 稚兒靈顆粒在230 nm 下的HPLC-PDA 指紋圖譜

2.1.11 共有峰的指認及特征峰的藥材歸屬分別取供試品溶液和對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄60 min 色譜圖；在230 nm 波長處測定芍藥內酯苷、芍藥苷、甘草苷、橙皮苷對照品溶液，其保留時間和紫外光譜與圖2 中3、4、5、9 峰相對應。共有峰的標定以（4 號）芍藥苷色譜峰為參照，計算樣品的10 個共有峰的相對保留時間、相對峰面積值，10 個峰的相對保留時間的RSD 值在0.2%～1.0%。10 個共有峰中1﹑3﹑4 號峰來源于白芍（麩炒），5 號峰來源于甘草，9 號峰來源于陳皮。

圖2 19 批稚兒靈顆粒的指紋圖譜及對照指紋圖譜

2.2 4 種成分的含量測定

2.2.1 供試品溶液制備供試品溶液的制備同“2.1.3”項，混合對照品溶液的制備同“2.1.2”項。

2.2.2 色譜條件色譜條件同“2.1.1”項。

2.2.3 系統適用性要求取上述混合對照品溶液、供試品溶液（編號S1）和空白溶液（甲醇）適量，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果各待測組分與前后色譜峰分離度均＞1.5，對稱因子在1.05～1.30，理論板數以芍藥苷峰計＞5000。陰性溶液對測定4 種成分無干擾。見圖3。

圖3 稚兒靈顆粒高效液相色譜圖

2.2.4 線性關系考察分別精密吸取“2.1.2”項下各對照品儲備液適量，分別置于50 mL 量瓶中，加甲醇定容，混勻，得系列線性工作溶液；精密吸取上述系列線性工作溶液，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以各待測成分的質量濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標、以峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，結果見表2。

表2 芍藥苷等4 種有效成分的回歸方程與線性范圍

2.2.5 精密度試驗取“2.2.4”項下混合系列線性工作溶液（芍藥內酯苷、芍藥苷、甘草苷、橙皮苷的質量濃度分別為19.384 4、38.681 2、19.494 0、34.384 2 μg·mL-1）適量，按“2.2.2”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果芍藥內酯苷、芍藥苷、甘草苷、橙皮苷的峰面積的RSD 分別為0.97%、0.60%、1.06%、0.48%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗取稚兒靈顆粒樣品（編號S1）6g，共6 份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。結果芍藥內酯苷、芍藥苷、甘草苷、橙皮苷含量的RSD 分別為1.71%、0.93%、1.16%、0.54%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.2.7 穩定性試驗取“2.2.1”項下供試品溶液（編號S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，芍藥內酯苷、芍藥苷、甘草苷、橙皮苷峰面積的RSD 分別為1.53%、0.61%、1.55%、0.38%（n＝8），表明供試品溶液于室溫下放置24 h 內穩定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗取已知含量的稚兒靈顆粒（編號S1）細粉約3 g，共9 份，分成3 組，精密稱定后，分別按樣品與對照品l∶0.5、l∶l、l∶1.5 的比例加入各對照品儲備液，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積并按外標法對照品比較法計算各成分加樣回收率及RSD。結果稚兒靈顆粒中芍藥內酯苷、芍藥苷、甘草苷、橙皮苷的平均回收率分別為96.7%、97.9%、98.8%、103.2%，RSD 分別為1.1%、0.8%、1.5%、0.6%（n=6）。

2.2.9 耐用性試驗取稚兒靈顆粒樣品（編號S1），按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，分別以不同儀器（Aglient 1260 高效液相色譜儀）﹑不同色譜柱（Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱）進樣測定，記錄4個成分的峰面積。結果表明，各共有峰的相對峰面積RSD 均＜2.0%，表明耐用性較好。

2.2.10 樣品含量測定取19 批稚兒靈顆粒樣品粉末，每份約6 g，共2 份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法對照品比較法計算各樣品含量。每份樣品平行操作2 次，取平均值。見表3。

表3 19 批稚兒靈顆粒樣品中芍藥苷等4 種有效成分的含量測定結果（n=2，mg·g-1）

2.3 聚類分析

在19 批稚兒靈顆粒指紋圖譜中，以測定的10個共有峰的峰面積為變量，采用IBM SPSS22.0 軟件進行分析，以Pearson 相關性為測度，采用組間聯接法繪制聚類分析圖，見圖4。

圖4 19 批稚兒靈顆粒樣品的聚類分析圖

由圖4 可知，當類間距為5 時，19 批樣品可聚為四類：S1﹑S2﹑S7 為一類；S3～S6 為一類；S8～S10 為一類；S11～S19 為一類。第一類為廣東元寧制藥和華潤三九制藥；第二類為廣西萬壽堂制藥；第三類為貴州遠程制藥；第四類為吉林省康福藥業。由此看出，同一廠家不同批次間的產品質量有較高的穩定性，不同廠家之間還存在差異。

3 討論

指紋圖譜技術能全面反映中藥的內在化學特征，具有整體性和模糊性特點，已成為控制中藥質量的最有效手段。本研究對5 個廠家19 批稚兒靈顆粒進行了部分成分指紋圖譜比較，結果表明，19批稚兒靈顆粒的HPLC 圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.90，表明不同廠家生產的稚兒靈顆粒的化學成分相似，使用的藥材及生產工藝較為穩定，一致性較好。含量測定結果顯示，芍藥內酯苷、芍藥苷、甘草苷、橙皮苷等4 種成分含量的RSD 分別為58.3%、54.9%、43.9%、44.8%，表明不同廠家的稚兒靈顆粒質量存在一定差異，這可能與原藥材基原的多樣性和復雜性有關，包括土壤、氣候等自然條件。貴州遠程制藥的各成分含量均明顯高于其它企業，提示該企業在原料的選擇和工藝的流程設計上有明顯的優勢。

綜上所述，所建指紋圖譜穩定、可行，含量測定方法簡便、準確、重復性好，此方法可用于稚兒靈顆粒的質量控制。