口瘡穴位貼主要成分的鑒別與含量測定*

倪玉佳，李 敏，陳 穎，董文燊，瞿發林

1 第904 醫院常州醫療區 藥劑科，常州 213000；2 南京中醫藥大學 翰林學院，泰州 225300；3第904 醫院 藥劑科，無錫 214000

口瘡是常見的口腔黏膜疾病[1]。中醫認為人體是一整體，各五臟六腑與組織器官之間存在緊密的關系，還包括生理與病理的各個方面[2]。在《素問·陰陽應象大論》中，有“脾主心”、“心主舌”的理論，認為口瘡由心脾經蘊熱所致[3]。而穴位貼能有效地刺激足底涌泉穴，使藥性經皮毛腠理滲入，藥力直達病灶，同時通過經絡運行傳至相應臟腑，從而治愈口腔潰瘍[4]。

口瘡穴位貼源于第904 醫院一臨床經驗方，由吳茱萸、大黃、川黃連等5 味藥材組成的貼膏劑，具有清熱瀉火、溫助脾腎等功效，在臨床上治療口瘡效果顯著、應用方便。為確保該貼劑質量可靠，本試驗對兩味主要藥材吳茱萸和大黃進行定性定量考察。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

ATX124 電子天平（島津公司）；Waters2487 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；ZF-20D 暗箱式紫外分析儀（英峪予華儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

口瘡穴位貼（批號：20190705、20190715、20190723、20200307、20200404、20200516、20200613、20200711，含膏量1.8 g/貼），實驗室自制。

對照品：吳茱萸堿、吳茱萸次堿、大黃素（批號分別為110802-201710、110801-201608、110756- 201913；純度分別為：99.6%、99.7%、96.0%）；對照藥材：吳茱萸、大黃（批號分別為120909-201510、120984-201202），均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純；三乙胺、乙醇、石油醚、鹽酸、磷酸、無水硫酸鈉、乙酸乙酯為分析純；純化水。

2 方法與結果

2.1 吳茱萸的鑒別

取貼劑（批號：20190705），除去蓋襯，精密稱取1g，加95%乙醇10 mL，搖勻并置于具塞錐形瓶，靜置30 min，超聲處理（30 ℃，100 Hz，30 min），過濾后即為供試品溶液①；另取陰性（缺吳茱萸）樣品1 g，按溶液①制備流程制成溶液②；分別取吳茱萸次堿、吳茱萸堿適量，加95%乙醇制成3.0、4.0 mg·mL-1的溶液③、④；取對照藥材吳茱萸0.4 g，按溶液①制備流程制成溶液⑤。吸取上述①②③④⑤溶液，分別為6、6、1、3、7 μL，在硅膠板（G）上進行點樣，選擇乙酸乙酯-三乙胺-石油醚（60～90 ℃）為展開劑，按3∶0.1∶7 比例，展開完成后于365 nm 紫外光下觀察[5]。見圖1。結果顯示，供試品與吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸藥材在相同位置上，顯現相同熒光斑點，其他成分無干擾。

圖1 吳茱萸的薄層圖譜

2.2 大黃的鑒別[6]

取貼劑（批號：20190705），除去蓋襯，精密稱取2 g 于錐形瓶中，加20 mL 甲醇，超聲處理（30 ℃，100 Hz，30 min），取其續濾液5 mL 蒸干，加10 mL 水溶解固體物，再加鹽酸1 mL，回流30 min 后，即刻冷卻至室溫，萃取2 次（乙醚20 mL/次），合并萃取液并蒸干，加二氯甲烷1 mL 使固體物溶解，過濾，濾液即為供試品溶液①[6]；另取陰性（缺大黃）樣品2 g，按溶液①制備流程制成陰性溶液②；取對照品大黃素適量，加甲醇制成1 mg·mL-1溶液③；另取對照藥材大黃0.2 g，按溶液①制備流程制成溶液④。吸取上述①、②、③、④溶液7、7、1、7 μL，在硅膠板（G）上點樣，冰乙酸-石油醚（30～60 ℃）-乙酸乙酯（1.2∶18∶5）為展開劑，展開，完成后于365 nm 紫外光下及氨氣熏蒸后觀察，見圖2。結果顯示，供試品與大黃藥材、大黃素在相同位置上，顯現相同熒光斑點，氨氣熏蒸后熒光斑點顯紅色。陰性溶液紫外檢視圖中斑點易混淆，氨氣熏蒸后干擾斑點消失，其他成分無干擾。

圖2 大黃的薄層圖譜

2.3 吳茱萸的含量測定

2.3.1 色譜條件色譜柱：Lichrosphe C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：水-乙腈（53∶47）；柱溫：30 ℃；檢測波長：225nm；流速：1.0mL·min-1；進樣量：20 μL。理論塔板數按吳茱萸堿計不低于2000。

2.3.2 溶液的制備對照品溶液（A）：精密稱取對照品吳茱萸堿、吳茱萸次堿適量，加甲醇制成含吳茱萸堿（83.7 μg·mL-1）、吳茱萸次堿（46.3 μg·mL-1）的混合對照品溶液。

供試品溶液（B）：取貼劑，除去蓋襯后，精密稱取1 g，置具塞錐形瓶中，加入70%乙醇25 mL，密塞稱定重量，超聲處理（100 Hz，40 min），冷卻至室溫，稱定后用70%乙醇補足失重，搖勻過濾，即得濾液[5]。

陰性溶液（C）：按口瘡穴位貼劑處方制備缺吳茱萸的樣品，同溶液（B）的制備流程制備陰性溶液。

2.3.3 專屬性考察按“2.3.1”項下色譜條件，分別測定溶液A、B、C，由圖3 可知，1、2 與相鄰色譜峰的分離度較好，陰性無干擾。

圖3 吳茱萸HPLC 色譜圖

2.3.4 線性關系考察精密吸取“2.3.2”項下的吳茱萸堿與吳茱萸次堿對照品儲備液適量，分別制成含吳茱萸堿3.3、6.7、16.7、83.7、167.3 μg·mL-1系列濃度，吳茱萸次堿1.9、3.7、9.3、46.3、92.5 μg·mL-1系列濃度，依次進樣，記錄其對應的峰面積。以橫坐標為吳茱萸堿、吳茱萸次堿的進樣濃度，縱坐標為其峰面積，得回歸方程分別為：Y 吳茱萸堿=2.512 6×104X－1.407 4×104（n=5，r=0.999 8）；Y 吳茱萸次堿=1.503 3×104X-7.064 7×103（n=5，r=0.999 8）。結果顯示，吳茱萸堿在3.3～167.3 μg·mL-1、吳茱萸次堿在1.9～92.5 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.3.5 精密度試驗精密吸取對照品溶液適量（A）進樣6 次，記錄其對應峰面積，計算吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積RSD 分別為0.84%、0.53%。表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩定性試驗取同一批貼劑樣品（批號：20190705）溶液20 μL，分別于0～20 h 連續進樣（間隔4 h/次），按“2.3.1”色譜條件測定。RSD 測定結果分別為1.48%和1.52%，表明溶液20 h 內穩定。

2.3.7 重復性試驗取同一批貼劑樣品（批號：20190705），按供試品溶液（B）制備方法制備6 份供試品溶液，按“2.3.1”色譜條件測定，記錄其對應峰面積，根據外標法（對照品比較法）分別計算得到吳茱萸堿、吳茱萸次堿的平均含量為1.096、0.662 mg·g-1，RSD分別為0.76%、0.87%，表明該法重復性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗精密稱取已知含量的口瘡穴位貼劑0.5 g（批號20190705），依次加入吳茱萸堿、吳茱萸次堿混合對照溶液適量（按50%、100%、150%比例），照“2.3.2”項下平行制備9 份，按“2.3.1”色譜條件進行測定。表明該方法準確度較好。計算得吳茱萸堿、吳茱萸次堿的平均回收率分別為98.13%、99.58%，RSD 分別為1.98%、1.37%。

2.4 大黃的含量測定

2.4.1 色譜條件與系統適用性要求色譜柱：Lichrosphe C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液-甲醇（35∶28∶37）；柱溫：25 ℃；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL。理論塔板數按大黃素峰計不低于2000。

2.4.2 溶液的制備對照品溶液（Ⅰ）：精密稱取對照品大黃素適量，加甲醇溶解制成含大黃素的對照品儲備液（118.6 μg·mL-1）。

供試品溶液（Ⅱ）：取貼劑，除去蓋襯后，精密稱取2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1h，取出冷卻至室溫后用甲醇補足重量，搖勻并過濾。精密量取續濾液5 mL 后蒸干，加8%鹽酸溶液20 mL 溶解固體物，再加入25 mL二氯甲烷，加熱回流30 min（水浴），即刻冷卻至室溫，移至分液漏斗中，用50 mL 二氯甲烷進行萃取3次（20 mL+15 mL+15 mL），合并收集二氯甲烷液。以無水硫酸鈉進行脫水，再次回收二氯甲烷至蒸干，用適量甲醇溶解固體物后轉移至25 mL 量瓶中，甲醇定容并搖勻，即為供試品溶液（Ⅱ）。

陰性溶液（Ⅲ）：按口瘡穴位貼劑處方制備缺大黃的樣品，同供試品溶液（Ⅱ）制備流程制備陰性溶液。

2.4.3 專屬性考察按“2.4.1”項下色譜條件分別測定溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。由圖4 可知，大黃素與相鄰色譜峰的分離度較好，陰性無干擾。

圖4 大黃HPLC 色譜圖

2.4.4 線性關系考察精密吸取“2.4.2”項下的大黃素對照品儲備液適量，分別制成大黃素1.2、2.4、4.7、11.9、23.7、118.6 μg·mL-1系列濃度，依次進樣測定，記錄其對應的峰面積，最終橫坐標為大黃素的進樣濃度，縱坐標為其峰面積，得回歸方程為Y 大黃素=7.892 9×104X+9.911 6×103（n=6、r=0.999 9）；大黃素在1.2～118.6 μg·mL-1范圍線性關系良好。

2.4.5 精密度試驗精密吸取大黃素對照品溶液，重復進樣6 次，記錄其對應峰面積，計算大黃素峰面積RSD 為0.74%。表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩定性試驗取同一批貼劑樣品（批號：20190705）溶液20 μL，分別于0～20 h 連續進樣（間隔4 h/次），按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定。RSD測定結果為1.73%，表明樣品溶液20 h 內穩定。

2.4.7 重復性試驗取同一批樣品（批號：20190705），按溶液（Ⅱ）方法制備6 份，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄其對應峰面積，按外標法計算（對照品比較法）大黃素的平均含量為145.39 μg·g-1，RSD 為1.85%，表明方法重復性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗精密稱取已知含量的口瘡穴位貼1.0 g（批號20190705），依次加入大黃素對照溶液適量（按50%、100%、150%的比例），照“2.4.2”項下平行制備9 份進行測定。表明本方法準確度較好。根據對照品比較法計算得大黃素的平均回收率為97.77%，RSD 為1.63%。

2.5 樣品含量測定

分別取8 份不同批次的口瘡穴位貼適量，按供試品制備方法分別制備供試品溶液，按 “2.3.1”和“2.4.1”項下的色譜條件分別進樣，每個樣品平行測定2 份，記錄吳茱萸堿、吳茱萸次堿、大黃素的峰面積，按外標法（對照品比較法）計算其平均含量。見表1。

表1 樣品含量測定結果（n=2）

3 討論

3.1 薄層色譜條件的優化

本實驗為使展開劑配制簡單，縮短實驗流程，提高工作效率，即參考相關文獻[5，6]，同時考察了多個展開劑體系[7]，包括石油醚-二氯甲烷-冰乙酸（9∶5∶0.5）；石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸（9∶2∶0.6）、（18∶5∶1）、（18∶5∶1.2）、（18∶5∶1.5）。最終選定最佳展開條件為石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸（18∶5∶1.2）。

3.2 提取條件的考察

吳茱萸生物堿屬于脂溶性化合物，易溶于有機溶劑[8]。本研究考察了不同提取溶劑（60%、70%、80%、95%乙醇、甲醇、乙酸乙酯）以及有無浸泡過程對試驗的影響。最終選定以70%乙醇超聲40min 提取效果最佳，且采用的提取溶劑安全環保，耗時較短。

3.3 含量限度的制定

根據含量測定的結果，考慮到藥材的質量會受其產地、來源、加工方式等差異的影響[9-11]，故以該8批貼劑的含量平均值向下浮動25%，同時參照《中國藥典》中原藥材的含量作為口瘡穴位貼中吳茱萸堿、吳茱萸次堿及大黃素的含量下限，暫定本品每貼劑含吳茱萸以吳茱萸堿與吳茱萸次堿合計不得少于2.4 mg；含大黃以大黃素計不得少于0.2 mg。