HILIC-MS/MS 法測定早產兒血漿中咖啡因的濃度

俞 平，文詩雨，趙 楊，房秋晨，陳相龍，曾女金，李 悅，陸 超，孫魯寧*，王永慶*

1 南京市溧水人民醫院，南京 211200;2南京醫科大學第一附屬醫院 臨床藥理研究室，南京 210029;3南京醫科大學 藥學院，南京 211166;4 江蘇省婦幼保健院 兒科，南京 210036

早產兒呼吸暫停（apnea of prematurity，AOP）是新生兒重癥監護中最常見且較為嚴重的臨床問題之一，持續的呼吸暫停會對早產兒及新生兒腦部及器官發育產生長期危害[1]。咖啡因是甲基黃嘌呤類藥物，主要通過拮抗腺苷受體、抑制磷酸二酯酶和動員細胞內鈣離子產生效應[2]，用藥后可迅速進入中樞神經系統，使中樞濃度接近血漿水平，外周化學感受器對CO2的敏感性提高，呼吸中樞輸出量增加，松弛平滑肌，增強橫膈肌活動幅度等[3]。咖啡因在2006 年已被中華醫學會兒科分會新生兒學組作為國內AOP 防治的推薦藥物。

在歐洲藥品局出臺的新生兒臨床藥物研究指南中，規定臨床研究相關的血液丟失量，每個新生兒在4 周內不超過其血容量的3%，每次不超過其血容量的1%[4]。故基于早產兒患者臨床試驗存在的倫理、頻繁抽血困難等問題，應使血漿需求量盡可能少的方法來測定新生兒血漿中的咖啡因濃度。

司徒冰等[5]采用LC-MS/MS 法測定早產兒咖啡因的血藥濃度，血樣量超過50 μL，且分析時間較長；另外，文獻[5，6]開發的方法前處理均需要萃取或旋干，較為繁瑣。本研究采用HILIC-串聯質譜聯用法（HILIC-MS/MS），建立了一種簡便、快捷的分析方法，血漿量僅需10 μL，用于測定早產兒靜脈泵注枸櫞酸咖啡因后血漿中咖啡因的濃度。

1 材 料

1.1 儀器和設備

液質聯用儀使用安捷倫1290 Infinity 超高效液相色譜儀；API 4000 三級四極桿串聯質譜、色譜工作站使用Analyst?軟件，均為美國應用生物公司產品；BP211D 型電子分析天平（德國賽多利斯集團）。

1.2 藥品和試劑

咖啡因（純度98%）、內標13C3-咖啡因（純度98%）均由Toronto Research Chemicals 公司提供；乙腈、甲醇、甲酸、甲酸銨為分析純；水為純化水。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱：Atlantis?HILIC Silica（2.1mm×150mm，3 μm）；柱溫：38 ℃；自動進樣器10 ℃；5 mmol·L-1甲酸銨溶液（含0.1%甲酸）為A 相，乙腈為B 相，以0.3 mL·min-1的流速梯度洗脫（條件為：0～2.8 min，A為10%；2.8～3.0 min，A 從10%→45%；3.0～4.5 min，A為45%；4.5～4.7 min，A 從45%→10%；4.7～7.0 min，A為10%）；進樣量：1.0 μL；每針分析時間7.0 min。

2.2 質譜條件

離子檢測方式：多重反應監測（MRM）；定量分析離子對：咖啡因m/z 195.1→138.1、內標（13C3-咖啡因）m/z 198.1→140.1；離子化方式：電噴霧離子化（ESI）；離子極性：正離子（Positive）；離子化電壓（IS）：5500 V；溫度：700 ℃；霧化氣（Gas 1）：345 kPa；渦輪氣（Gas 2）：345 kPa；氣簾氣（Curtain Gas）：241 kPa；碰撞氣（Collision Gas）：69 kPa。

2.3 溶液的制備

2.3.1 咖啡因儲備液及工作液精密稱取10.19 mg咖啡因對照品（相當于咖啡因9.99mg·mL-1）加于10mL量瓶中，再加入50%甲醇溶解后定容，混勻即可配制成濃度為0.999mg·mL-1的咖啡因儲備液。用50%甲醇稀釋咖啡因儲備液，配制成濃度分別為0.200、0.400、1.20、4.00、12.0、40.0、120、180、200μg·mL-1標準曲線用咖啡因工作液，以及濃度分別為0.500、6.00、10.0、160μg·mL-1的質控用咖啡因工作液。

2.3.2 含內標的沉淀劑精確稱量13C3-咖啡因對照品5.12 mg（相當于13C3-咖啡因5.00 mg·mL-1），于5 mL 量瓶中，加入50%甲醇溶解并定容，混合均勻，配制成1.00 mg·mL-1的13C3-咖啡因儲備液。用移液器將100 μL 濃度為1.00 mg·mL-1的13C3-咖啡因儲備液移取至1.5 mL EP 管中，加入50%甲醇900 μL，混合均勻，得到濃度為100 μg·mL-1的13C3-咖啡因內標工作液。然后在100 mL 量瓶中加入100 μL 上述配制好的內標工作液，用乙腈定容，混合均勻，得到含13C3-咖啡因（100 ng·mL-1）的含內標的沉淀劑。

2.4 血漿樣本預處理

將10 μL 血漿樣本加入至1.5 mL EP 管中，加入100 μL 含內標的沉淀劑，室溫下渦旋10 min（強度2000r·min-1），再于4℃下、16000r·min-1離心15min，吸取上清液10 μL 加至裝有90 μL 乙腈的進樣瓶中，渦旋，混合均勻后進行HILIC-MS/MS 分析。

2.5 標準曲線及質控樣本的配制和處理

將2.5 μL 相應濃度的標準曲線用或質控用工作液加入到1.5 mL EP 管中，室溫自然揮干，加入10 μL空白血漿溶液，渦旋15 s，混勻，配制成含咖啡因濃度分別為0.0500、0.300、1.00、10.0、30.0、45.0、50.0 μg·mL-1的標準曲線用含藥血漿樣本和濃度分別為0.125、1.50、2.50、40.0 μg·mL-1的質控用含藥血漿樣本。后續處理同“2.4”項。

3 結果

3.1 特異性考察

取6 份不同來源的空白血漿樣本，除不添加內標外，按照“2.4”項方法配制和處理后進行HILICMS/MS 分析，以考察是否有內源性干擾成分影響測定。咖啡因的保留時間在2.37 min 左右；咖啡因的同位素內標的保留時間在2.37 min 左右，見圖1。實驗表明，咖啡因、咖啡因的同位素內標峰形良好，在保留時間處沒有干擾，本方法具有較高的選擇性。

圖1 人血漿中咖啡因的代表色譜圖

3.2 基質效應及提取回收率

將6 種不同來源的10 μL 空白血漿，分別置于1.5 mL EP 管中，按“2.5”方法配制含咖啡因濃度為0.125、1.50、40.0 μg·mL-1的標準含藥血漿樣品，每個濃度配制3 份，按“2.4”項下方法處理，即為提取樣本。取6 種不同來源空白血漿20 μL，加入200 μL乙腈，渦旋10min，于4℃、16000r·min-1離心15min，將空白血漿提取液110 μL 收集在另一1.5 mL EP管中。加入2.5 μL 的0.500、6.00、160 μg·mL-1工作液，制備咖啡因濃度分別為0.125、1.50、40.0 μg·mL-1的含藥血漿樣本，每種濃度制備3 份，再加入4.00μg·mL-1內標溶液2.5 μL，渦旋離心，即為“未提取樣本”。進樣分析，以峰面積比計算提取回收率，公式：

提取回收率（%）=提取樣本的平均響應值（峰面積）/未提取樣品的平均響應值（峰面積）×100%。

取6 種不同來源空白血漿20 μL，操作同“未提取樣本”，制備含咖啡因濃度為0.125、40.0 μg·mL-1的基質效應樣本，每個濃度配制3 份。取20 μL 初始流動相替代空白血漿，其余操作同基質效應樣本，即為基質效應對照樣本，每個濃度配制3 份。進樣分析，以峰面積比計算基質效應。公式：

基質效應（%）=基質效應樣本的平均響應值（峰面積）/基質效應對照樣本的平均響應值（峰面積）×100%。

考察咖啡因在血漿中的基質效應和提取回收率，結果見表1。這表明提取回收率符合生物樣本分析要求，無明顯基質效應。

表1 基質效應及提取回收率測定結果

3.3 標準曲線及定量下限

按“2.5”項下方法配制并處理含咖啡因濃度分別為0.0500、0.300、1.00、3.00、10.0、30.0、45.0、50.0 μg·mL-1的標準含藥血漿，同時制備空白血漿樣本（DB）和僅含內標的血漿樣本（BK），進行HILIC-MS/MS分析，并記錄色譜圖。計算咖啡因的峰面積As和內標峰面積Ai之比f（f=As/Ai），用峰面積之比f 對血藥濃度C 進行加權回歸計算，得到標準曲線f=0.001 06C+0.018 9（r=0.999 3）。結果表明，血漿中咖啡因在濃度0.050 0～50.0 μg·mL-1線性關系良好，最低定量下限為0.050 0 μg·mL-1，且信噪比＞10。

3.4 精密度和準確度試驗

按 “2.5” 項下方法配制并處理咖啡因濃度為0.0500、0.125、1.50、40.0 μg·mL-1的標準含藥血漿樣本，每個濃度制備5 份，同時制備兩條隨行標準曲線，進行3 批批內、批間精密度和準確度考察，結果見表2。這表明咖啡因在這4 種濃度的批內、批間精密度、準確度均符合相關生物樣本分析要求。

表2 血漿中咖啡因方法精密度與準確度測定結果

3.5 穩定性試驗

分別新鮮配制咖啡因儲備液和咖啡因濃度分別為0.0500、50.0 μg·mL-1標準工作液，平行制備2 份，考察在室溫及10 ℃進樣器中放置12 h 的穩定性，稀釋至100 ng·mL-1進樣，咖啡因相對偏差（RE）均不超過5.3%。這表明咖啡因儲備液和標準工作液在室溫及10 ℃進樣器中放置12 h 的穩定性均良好。

按 “2.5” 項方法配制含咖啡因濃度分別為0.125、40.0 μg·mL-1的標準含藥血漿樣本，每種濃度配制9 份。3 份在進樣器中放置24 h，RE 為-4.3%～-3.8%；3 份在室溫下放置5 h，RE 為-6.7%～6.7%；3 份反復凍融3 次，RE 為-11.4%～7.7%。這表明咖啡因血漿樣本在各種環境條件下穩定性均良好。

3.6 殘留效應

按照“2.5”項下方法配制并處理5 份含咖啡因濃度為50.0 μg·mL-1的標準含藥血漿樣本和5 份空白血漿樣本，交替進樣，考察高濃度樣本進樣后，再分析空白樣本時，觀察色譜圖中是否有殘留。若空白樣品中分析物色譜峰面積在定量下限的20%以下，且不超過內標的5%，則認為其合格。結果表明，該方法無殘留效應，不會影響后續樣本濃度的測定。

3.7 方法應用

臨床上使用枸櫞酸咖啡因注射液（1 ml∶20 mg）負荷劑量20mg·kg-1，靜脈輸液泵輸注30min，24h 后給予維持劑量10mg·kg-1，輸注時間15min。給予枸櫞酸咖啡因治療的早產兒（胎齡<31 周，體重<1500 g），于7 天后采集維持劑量輸注完成后30 min 的血樣，取離心后上清液于-80 ℃冰箱保存待測，使用本方法行咖啡因的血藥濃度檢測。4 例早產兒胎齡在29～31周，體重范圍為1000～1200 g，連續服用枸櫞酸咖啡因7 天后，測得咖啡因血藥濃度分別為31.1、53.5、51.1、28.5 μg·mL-1，為（41.1±13.1）μg·mL-1。

4 討論

本研究主要考察了苯基柱、T3 柱以及HILIC柱，初期嘗試使用C18柱對咖啡因進行分離，發現需要98%、甚至100%的水相，雖然最終有所保留，但響應較低。鑒于早產兒的特殊性，樣本采集點數及量均與成人有較大區別，從倫理角度考慮建立一種高靈敏度、血漿用量少的分析方法是十分必要的。HILIC 柱采用兩性離子修飾的固定相，具有高度極性的表面，適用于極性和親水性化合物的分析。研究發現，咖啡因在HILIC 柱中，即使在高有機相的條件下，也具有合適的保留時間，且呈現高靈敏度，有效減少所需的血漿樣本體積。此外，進樣量只需1 μL，能有效降低基質效應。在流動相的選擇上，發現在5 mmol·L-1甲酸銨水溶液中加入0.1%的甲酸能改善峰形，減輕殘留效應。同時采用梯度洗脫，減少基質效應，更加適用于生物樣本的分析。

在文獻[6，7]報道中，咖啡因的提取方法有液相萃取法、固相萃取法等，操作繁瑣、昂貴費時；趙婷等[6]使用甲醇直接沉淀蛋白，周玉[8]使用高氯酸直接沉淀蛋白，兩者處理雜質較多，干擾測定；本研究以乙腈作為沉淀劑，除去血漿中的蛋白質和雜質，該操作方法簡單易行。另外，在目前檢測成人或早產兒咖啡因的方法中，所需的血樣體積較多，如司徒冰等[5]的研究中需要200μL 血清，而本法只需要10μL 的血漿樣本進行前處理，更符合倫理要求，更適用于早產兒研究。

說明書中早產兒咖啡因的有效血藥濃度為8～30 μg·mL-1，本研究中4 例早產兒咖啡因平均血藥濃度為41.4 μg·mL-1，超過有效血藥濃度，可適當降低用藥劑量，以減少不良反應的發生。另外，枸櫞酸咖啡因血藥濃度在早產兒人群的不同個體及胎齡中存在較大差異，故監測早產兒咖啡因血藥濃度對于評估療效、個體化調整用藥有重要臨床意義。

本研究建立的方法靈敏、高效、分析時間較短、血樣用量少且前處理簡單便捷，可用于早產兒靜脈泵注枸櫞酸咖啡因后的咖啡因血藥濃度監測。