芩連膠囊中重金屬及其膠囊殼中鉻元素的含量測(cè)定及安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

周娟娟，吳 莉，馮有龍，張妤琳，吳嫣艷

江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 210019

芩連膠囊由黃芩、連翹、黃連、黃柏、赤芍、甘草等中藥組成，具有清熱解毒、消腫止痛等功效[1]，臨床上用于臟腑蘊(yùn)熱、頭痛目赤、口鼻生瘡、熱痢腹痛、濕熱帶下、瘡癤腫痛等[2]。目前對(duì)芩連膠囊的報(bào)道多為化學(xué)成分、臨床藥理作用等，鮮有對(duì)其安全性的研究，尤其對(duì)中成藥及膠囊殼中的重金屬含量及安全評(píng)估尚未見(jiàn)報(bào)道。

由于土壤污染及中藥自身蓄積等方面的原因，目前中藥材中重金屬殘留的現(xiàn)象普遍存在，主要涉及的有鉛、鎘、砷、汞、銅等，這不僅會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生潛在的影響和威脅，還影響其藥效發(fā)揮和用藥安全[3，4]。鉻是明膠空心膠囊殼中的重金屬成分之一，過(guò)量攝入會(huì)造成中毒，及時(shí)準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)膠囊殼中鉻的含量尤為重要[5]。因此，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）對(duì)芩連膠囊中5 種重金屬元素鉛（Pb）、鎘（Cd）、砷（As）、汞（Hg）、銅（Cu）同時(shí)進(jìn)行定量檢測(cè)，并利用原子吸收分光光度法（AAS）對(duì)其膠囊殼中的鉻元素進(jìn)行含量測(cè)定，且依據(jù)相關(guān)法規(guī)[6，7]，對(duì)其進(jìn)行安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以期為芩連膠囊和其他中藥制劑的安全評(píng)價(jià)和制訂重金屬及有害元素殘留限度提供參考。

1 材 料

1.1 儀器

Agilent 7700 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；PE 900Z 原子吸收儀（美國(guó)珀金埃爾默有限公司）；Mars 6 微波消解儀（美國(guó)CEM 公司）；BS21S 型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試劑

鉛、鎘、砷、汞、銅單元素對(duì)照品溶液（濃度均為1000 μg·mL-1，物質(zhì)批號(hào)為GBW08619、GBW08612、GBW08611、GBW08617、GBW08615）均來(lái)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；鍺、銦、鉍、鉻單元素對(duì)照品溶液（濃度均為1000 μg·mL-1，物質(zhì)批號(hào)為GSB04-1728-2004、GSB04-1731-2004、GSB04-1719-2004、GSB04-1723-2004），均購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。硝酸為色譜純，水為去離子水。

1.3 樣品

芩連膠囊為國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品，共計(jì)16 批次，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 鉛、鎘、砷、汞、銅的測(cè)定方法

2.1.1 ICP-MS 儀器工作條件通過(guò)儀器設(shè)置的調(diào)諧程序，采用氦氣碰撞反應(yīng)池模式，用調(diào)諧液對(duì)儀器質(zhì)量軸、分辨率、靈敏度、雙電荷、氧化物進(jìn)行優(yōu)化，所得參數(shù)：射頻功率1550 W；霧化氣流速0.99 L·min-1；等離子氣體流速15 L·min-1；輔助氣流速1.0 L·min-1；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速0.1 r·s-1；等離子體模式為He 模式；重復(fù)次數(shù)3 s。

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 對(duì)照品系列溶液及內(nèi)標(biāo)溶液：精密吸取Pb、Cd、As、Cu 各對(duì)照品溶液，用2%硝酸逐級(jí)稀釋制成相應(yīng)多元素質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品系列溶液。

精密吸取Hg 單元素對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用2%硝酸逐級(jí)稀釋制成Hg 對(duì)照品系列溶液。級(jí)別及濃度見(jiàn)表2。

表2 混合對(duì)照品系列溶液濃度

2.1.2.2 供試品溶液：取本品0.5 g，精密稱定，置聚四氟乙烯微波消解罐中，加硝酸5 mL，混勻，置微波消解儀中，開(kāi)始樣品消解。在0～5 min，由初始溫度升至120 ℃，維持5 min；在5～8 min 由120 ℃升至150 ℃，維持2 min；在8～13 min 由150 ℃升至180 ℃；在13～23 min 由180 ℃升至190 ℃。消解完全后，冷卻消解液至60 ℃以下，取出消解罐，在通風(fēng)櫥中放冷，將消解液轉(zhuǎn)入50 mL 聚四氟乙烯量瓶中，用少量水洗滌消解罐數(shù)次，合并洗液于量瓶中，用水定容后搖勻，即得。

除不加樣品外，同法制備空白溶液。

2.1.3 含量測(cè)定測(cè)定選取同位素為208Pb、114Cd、75As、202Hg、63Cu，其中208Pb 和202Hg 以209Bi 作為內(nèi)標(biāo)，114Cd以115In 作為內(nèi)標(biāo)，75As 和63Cu 以72Ge 作為內(nèi)標(biāo)。采用在線內(nèi)標(biāo)法用蠕動(dòng)泵與樣品混合后進(jìn)入ICP-MS儀，按“2.1.1”項(xiàng)下儀器條件進(jìn)行測(cè)定。

2.1.4 線性關(guān)系考察和檢測(cè)限將“2.1.2.1”項(xiàng)下系列對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣分析，以對(duì)照品濃度X 為橫坐標(biāo)，以對(duì)照品峰強(qiáng)與相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)元素峰強(qiáng)比值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各元素對(duì)照品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)以及檢測(cè)限（見(jiàn)表3）。5 種元素線性關(guān)系均良好。

表3 鉛、鎘、砷、汞、銅各元素的線性關(guān)系結(jié)果

2.1.5 精密度試驗(yàn)取標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)同一濃度的混合對(duì)照品溶液和汞對(duì)照品溶液，重復(fù)測(cè)定6次，記錄測(cè)量值，結(jié)果Pb、Cd、As、Hg、Cu 測(cè)量值的RSD 分別為1.2%、0.6%、1.1%、0.8%、1.5%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)取批號(hào)為190704 的樣品，按“2.1.2.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.1.1”儀器條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果鉛、鎘、砷、汞、銅的平均值（n=6）分別為1.8430、0.2984、0.5351、0.0070、1.8798 mg·kg-1，RSD 分別為1.6%、1.9%、1.9%、1.5%、0.9%。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取已知含量的供試品溶液（批號(hào)：190704）適量，分別放置0、2、4、8、16、24 h 測(cè)定，結(jié)果Pb、Cd、As、Hg、Cu 5 種元素 的RSD 分別為1.1%、0.9%、0.8%、1.0%、1.2%，表明5 種元素溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)取同一批已知含量的樣品（批號(hào)：190704）6 份，每份約0.25 g，精密稱定，置聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加“2.1.2.1”項(xiàng)下多元素混合對(duì)照品溶液（級(jí)別6）1.0mL，按“2.1.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)線性回歸方程得到加樣樣品中的各元素含量，計(jì)算回收率，鉛、鎘、砷、汞、銅的平均加樣回收率分別為92.3%、95.6%、97.5%、95.0%、99.3%，RSD（n=6）分別為2.3%、1.9%、2.2%、1.6%、1.8%。結(jié)果表明本方法具有良好的準(zhǔn)確性。

2.1.9 樣品含量測(cè)定按“2.1.2.2”項(xiàng)下方法平行制備2 份樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，以回歸方程分別計(jì)算樣品中各元素的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品中Pb、Cd、As、Hg、Cu 的含量（mg·kg-1，n=2）

2.2 鉻的測(cè)定方法

2.2.1 AAS 儀器工作條件配備石墨爐自動(dòng)進(jìn)樣器。鉻空心陰極燈，波長(zhǎng)357.9 nm，狹縫0.7 nm，燈電流22 mA，石墨爐原子化器，氬氣為保護(hù)氣，背景校正為塞曼校正。石墨爐工作條件升溫程序：①干燥溫度以150 ℃保持30 s；②灰化溫度以1200 ℃保持20 s；③原子化溫度以2300 ℃保持5 s；④凈化溫度以2450 ℃保持3 s。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對(duì)照品系列溶液：精密量取鉻元素對(duì)照品溶液適量，用2%硝酸溶液逐級(jí)稀釋成每毫升含鉻25 ng 的溶液，再由自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)稀釋成0、5、10、15、20、25 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2.2 供試品溶液：精密稱定本品0.25 g，置聚四氟乙烯微波消解罐中，加硝酸5 mL，混勻，預(yù)消解30 min（100 ℃），置微波消解儀中，開(kāi)始樣品消解：0～5min，由初始溫度升至120℃，維持10min；15～20min由120 ℃升至190 ℃，維持20 min。消解完全后，消解液冷至60 ℃以下，取出消解罐置電熱板上緩緩加熱至紅棕色蒸汽揮盡并近干，用水轉(zhuǎn)移至25 mL 聚四氟乙烯量瓶中，以少量水洗滌消解罐數(shù)次，洗液合并同一量瓶中，水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 含量測(cè)定取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，以石墨爐為原子化器，照原子吸收分光光度法[8]（《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則0406 第一法），在357.9 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定，計(jì)算，即得。

2.2.4 線性關(guān)系和檢測(cè)限將“2.2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品系列溶液進(jìn)樣分析，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得鉻元素的回歸方程：Y=1.756×10-2X+1.010×10-3，r=0.999 9，表明鉻元素濃度在0～25 ng·mL-1范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。檢測(cè)限為0.4 mg·kg-1。

2.2.5 精密度試驗(yàn)取標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)同一濃度的對(duì)照品溶液，重復(fù)測(cè)定6 次，結(jié)果RSD 為1.8%（n=6），表明儀器具有良好的精密度。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次樣品（編號(hào)2）適量，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，按“2.2.1”儀器條件測(cè)定，結(jié)果平均值（n=6）為0.3 mg·kg-1，RSD 為1.3%。表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取已知含量的供試品溶液（編號(hào)2）適量，分別放置0、2、4、8、16、24 h 測(cè)定，結(jié)果RSD 為1.1%，表明該元素溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)取同一批次已知含量的樣品（編號(hào)2）6 份，每份約0.12 g，精密稱定，分別精密加入各測(cè)定元素相應(yīng)的對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)線性回歸方程得到加樣樣品中的鉻元素含量，計(jì)算回收率，結(jié)果鉻的平均加樣回收率為98.1%，RSD（n=6）為1.9%。表明本方法具有良好的準(zhǔn)確性。

2.2.9 樣品含量測(cè)定以“2.2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備樣品2 份，按“2.2.3”項(xiàng)下儀器條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品中Cr 的含量（mg·kg-1，n=2）

2.3 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

實(shí)驗(yàn)分別參照《ICH 指導(dǎo)原則Q3D 元素雜質(zhì)指南》和《中國(guó)藥典》2020 年版四部9302“中藥有害殘留物限量制定指導(dǎo)原則”建立有害元素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型。

評(píng)估模型①：參考ICH Q3D，按公式1 計(jì)算最大允許濃度，PDE 為每日允許暴露量；根據(jù)芩連膠囊說(shuō)明書(shū)最大服用劑量為每日口服一次4 粒，一日3 次，每粒為0.44 g，日最大服用劑量為5.28 g 計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果

評(píng)估模型②[6，7]：參照《中國(guó)藥典》2020 年版，按公式2 計(jì)算。

L 為最大限量理論值（mg·kg-1）；A 為每日允許攝入量（μg·kg-1）；W 為人體平均體質(zhì)量（kg），一般按63 kg 計(jì)；M 為每日人均可服用的最大劑量（kg），芩連膠囊M 按日最大服用劑量為5.28 g；TA為平均壽命天數(shù)，一般為365 d×70 年；EF為中藥服用頻率（d/年），設(shè)為每年90 d；ED為一生服用中藥的暴露年限，設(shè)為20 年；t 為重金屬元素的轉(zhuǎn)移率（%），中成藥t 為100%；10 為安全因子，表示每日由中藥材及其制品中攝取的重金屬量不大于日總暴露量（包括食物和飲用水）的10%。

由表6 顯示，芩連膠囊中重金屬元素Pb、Cd、As、Hg、Cu 和Cr 的含量均低于《中國(guó)藥典》2020 年版和《ICH 指導(dǎo)原則Q3D 元素雜質(zhì)指南》規(guī)定的限度，此方法為廠家產(chǎn)品進(jìn)行重金屬有害元素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。

3 討論

重金屬問(wèn)題已經(jīng)成為中藥出口和阻礙中醫(yī)藥發(fā)展的主要問(wèn)題。有研究表明，重金屬元素具有積累性、食物鏈傳遞性和不易降解性，易在人體內(nèi)蓄積，當(dāng)達(dá)到一定含量時(shí)，可導(dǎo)致各種疾病發(fā)生[8]。

重金屬及有害元素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估旨在科學(xué)、合理研究中藥用藥安全性?！吨袊?guó)藥典》中僅對(duì)芩連膠囊處方中的甘草[6]重金屬及有害元素含量作出了規(guī)定。由于芩連膠囊為復(fù)方制劑，單純采用此標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行安全評(píng)價(jià)不盡合理?！禝CH 指導(dǎo)原則Q3D 元素雜質(zhì)指南》中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型通俗易懂，使用簡(jiǎn)便，多適用于化學(xué)藥品，對(duì)于中藥及其相關(guān)制品可能存在一定的評(píng)價(jià)風(fēng)險(xiǎn)偏差；《中國(guó)藥典》2020 年版的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型計(jì)算相對(duì)復(fù)雜，但評(píng)估元素的每日允許攝入量不易獲得；采用2 種模型相結(jié)合的方式進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，可呈揚(yáng)優(yōu)補(bǔ)缺之效。

對(duì)本次檢測(cè)的16 批芩連膠囊進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，表明部分樣品中Pb、Cd、As 仍有較多的殘留，說(shuō)明仍需持續(xù)加強(qiáng)中藥材種植中對(duì)土壤、化肥等的選擇和管理，嚴(yán)控重金屬超標(biāo)，提高中藥質(zhì)量，力求達(dá)到以環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)的綠色認(rèn)證制度要求。