高效液相色譜法測(cè)定腰痛丸中蛇床子素、升麻素苷和橙皮苷的含量

仇其原，張 卓，朱干紅

1 鹽城市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鹽城 224000；2 鹽城市中醫(yī)院，鹽城 224000

腰痛丸（Ⅰ）為棕褐色至棕黑色的水蜜丸；氣微香，味稍微苦，甘，辛。其由15 味中藥配伍組成，方中獨(dú)活、防風(fēng)、防己、威靈仙、續(xù)斷、制川烏、制草烏、蒼術(shù)為君藥，主祛風(fēng)散寒除濕；干姜、肉桂以溫中散寒、通絡(luò)止痛，烏梢蛇、蜈蚣以祛風(fēng)通絡(luò)、解痙鎮(zhèn)痛共為臣藥；茯苓、陳皮以利水滲濕、健脾益胃為佐藥；甘草為使藥，調(diào)和諸藥，并降低制川烏、制草烏的毒性。該藥主治祛風(fēng)散寒、通絡(luò)止痛，風(fēng)寒腰痛等癥。

腰痛丸（Ⅰ）中，獨(dú)活、防風(fēng)、陳皮的有效成分分別為蛇床子素[1]、升麻素苷[2]、橙皮苷[3]。相關(guān)藥理學(xué)試驗(yàn)表明，蛇床子素、升麻素苷和橙皮苷是腰痛丸（Ⅰ）發(fā)揮藥效作用的主要的活性成分，建立這3 種有效成分（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）的含量測(cè)定方法，對(duì)于增加腰痛丸（Ⅰ）的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的質(zhì)量研究具有積極的作用[4]。

圖1 腰痛丸（Ⅰ）中獨(dú)活、防風(fēng)、陳皮的有效成分及結(jié)構(gòu)式

中藥復(fù)方制劑的成分復(fù)雜，僅憑單味藥的定性方法并不能全面有效控制腰痛丸（Ⅰ）質(zhì)量與療效的一致性。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法，以腰痛丸（Ⅰ）中獨(dú)活、防風(fēng)、陳皮的各有效成分蛇床子素、升麻素苷、橙皮苷作為指標(biāo)性成分，建立同時(shí)測(cè)定其含量的方法，并完成方法學(xué)研究，以可靠的方法及數(shù)據(jù)依據(jù)[3]，為建立腰痛丸（Ⅰ）制劑質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)提供可行性方案。

1 儀器與藥品、試劑

儀器：Waters2695 高效液相色譜儀、Waters2996二極管陣列紫外檢測(cè)器（PAD），Empower 色譜工作站（美國(guó)Waters 公司）；XS205 DU 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

對(duì)照品：蛇床子素（批號(hào)110822-200407）、升麻素苷（批號(hào)111522-201209）、橙皮苷（批號(hào)110721-201316，110721-201115）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。供試品：腰痛丸（Ⅰ）（鹽城市中醫(yī)院制劑室，批號(hào)190115、190601、190907）。試劑：甲醇、醋酸銨溶液為化學(xué)純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液精密稱(chēng)取蛇床子素對(duì)照品15 mg，置于100 mL 量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，即得對(duì)照品溶液（1）；精密稱(chēng)取升麻素苷對(duì)照品15 mg，置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，即得對(duì)照品溶液（2）；精密稱(chēng)取橙皮苷對(duì)照品15 mg，置于20 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，即得對(duì)照品溶液（3）。依次從對(duì)照品溶液（1）、（2）、（3）中精密吸取1、1、2 mL，置于同一20 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，即得混合對(duì)照品溶液①。同法依次從對(duì)照品溶液（1）、（2）、（3）中精密吸取2、2、4 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，即得混合對(duì)照品溶液②。

2.1.2 供試品溶液從3 個(gè)批次中隨機(jī)稱(chēng)取腰痛丸（Ⅰ）適量，研細(xì)，取約5 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇100 mL，稱(chēng)重，水浴回流2 h，放冷，稱(chēng)定重量，加甲醇補(bǔ)到原先的重量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Waters CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.2 mol·L-1醋酸銨溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫程序?yàn)? min 80%A，20B；30 min 35A，65B；50 min 35A，65B；檢測(cè)波長(zhǎng)：284 nm（升麻素苷、橙皮苷），324 nm（蛇床子素）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。系統(tǒng)適用性要求：供試品色譜圖中，升麻素苷、橙皮苷、蛇床子素與其他峰的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)不低于8000。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)以“2.1”項(xiàng)下方法所得供試品溶液及混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行專(zhuān)屬性試驗(yàn)。見(jiàn)圖2。經(jīng)全波長(zhǎng)掃描圖譜的對(duì)比，供試品中蛇床子素、升麻素苷和橙皮苷峰與各對(duì)照品峰均得到指認(rèn)，并達(dá)到基線分離，分離度良好，符合專(zhuān)屬性及系統(tǒng)適用性要求。

圖2 腰痛丸（Ⅰ）專(zhuān)屬性試驗(yàn)色譜圖

2.3.2 線性與范圍依次從對(duì)照品溶液（1）、（2）、（3）中精密移取適量制成線性溶液，其中蛇床子素的梯度濃度為3.8、7.5、15.0、22.5、30.0 μg·mL-1；升麻素苷及橙皮苷的梯度濃度均為38、75、150、225、300 μg·mL-1；通過(guò)“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以線性溶液中各成分相應(yīng)的濃度C（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積Y（mAu*s）為縱坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸分別得回歸方程：蛇床子素Y=5.67×105C+2.22×104，r2=0.996 0；升麻素苷Y=2.00×106C+2.30×104，r2=0.998 0；橙皮苷Y=1.00×106C+1.05×105，r2=0.998 0。在相應(yīng)的線性范疇內(nèi)，3 成分均呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)取“2.1”項(xiàng)下所配供試品溶液及混合對(duì)照品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別計(jì)算各指標(biāo)性成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），蛇床子素、升麻素苷、橙皮苷峰面積RSD分別為0.44%、0.94%、0.32%。表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批號(hào)的腰痛丸（Ⅰ）制備供試品溶液，于0、2、4、8、16、24 h 按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得供試品溶液中蛇床子素、升麻素苷、橙皮苷的峰面積的RSD 分別為：1.06%、0.93%、0.46%，表明供試品溶液24 h 內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.3.5 重復(fù)性考察取同一批號(hào)腰痛丸（Ⅰ）平行制備6 份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別計(jì)算各指標(biāo)性成分含量的RSD 值。結(jié)果蛇床子素、升麻素苷、橙皮苷的含量RSD 分別為0.91%、0.74%、0.13%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)取已知含量的腰痛丸（Ⅰ）5g，共5 份，置于具塞瓶中，精密加入蛇床子素對(duì)照品溶液（0.5 mg·mL-1）1.0 mL，升麻素苷對(duì)照品溶液（3.0 mg·mL-1）1.0 mL，橙皮苷對(duì)照品溶液（10 mg·mL-1）1.0 mL，加甲醇100 mL，稱(chēng)重，水浴回流2 h，放冷，稱(chēng)重，加甲醇補(bǔ)到原先的重量，搖勻，濾過(guò)，即得加樣回收率試驗(yàn)的供試品溶液。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并根據(jù)公式：回收率=（實(shí)測(cè)量-供試品所含被測(cè)成分量）/加入對(duì)照品量×100%，計(jì)算回收率，蛇床子素、升麻素苷、橙皮苷的加樣回收率分別為98.43%、98.20%、98.50%，可以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 樣品含量測(cè)定

取3 個(gè)批號(hào)腰痛丸（Ⅰ）樣品適量，共2 份，依照以上方法配制供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，平均含量結(jié)果見(jiàn)表1。表明所建立的高效液相色譜方法檢測(cè)腰痛丸（Ⅰ）中蛇床子素、升麻素苷以及橙皮苷的含量準(zhǔn)確可行。

表1 樣品含量測(cè)定（n=2）

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

在流動(dòng)相的選擇中，曾考察不同比例的甲醇-0.2 mol·L-1醋酸銨溶液系統(tǒng)和甲醇-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以前者作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，所得蛇床子素、升麻素苷和橙皮苷各組分的峰形良好，且3 種組分分離度都符合要求。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本實(shí)驗(yàn)參考2020 版《中國(guó)藥典》[5]中蛇床子素、升麻素苷和橙皮苷的檢測(cè)波長(zhǎng)，分別進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果升麻素苷和橙皮苷在波長(zhǎng)284 nm 處均有較大吸收；另參考相關(guān)文獻(xiàn)，蛇床子素在波長(zhǎng)324 nm處有最大吸收[4]。故分別確定之。

4 小 結(jié)

建立了HPLC 法同時(shí)測(cè)定腰痛丸（Ⅰ）中蛇床子素、升麻素苷和橙皮苷的含量。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法簡(jiǎn)便快速、結(jié)果精確可靠，可作為腰痛丸（Ⅰ）中上述3 種指標(biāo)成分的質(zhì)量控制方法，為本品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供有效的依據(jù)。