痔寧片等5 種含槐花/米中成藥中黃酮類成分測定研究

馬旭倩，王李杰，陸宇婷，宋 敏，德拉姆皮埃爾，杭太俊*

1 中國藥科大學 藥學院，南京 211198；2 中國藥科大學 理學院，南京 211198

痔瘡是發病率較高的常見疾病，采用中醫藥遵循辨證論治原則，對于輕中度痔瘡的預防和治療，效果良好[1，2]。痔寧片、地榆槐角丸、槐角丸、痔康片和槐花散是中醫治療痔瘡下血證的5 種常用中藥制劑（見表1），處方中都含有槐花或槐米，再輔以黃芩、枳殼等其他藥味，均含有蘆丁等黃酮類特征有效成分[3-6]，起到涼血止血、修復創面、清肝瀉火的痔瘡治療作用。

表1 5 種治療痔瘡中成藥的特征信息

在這些治療痔瘡的中藥制劑中，《中國藥典》2020 版質量標準除有特征成分鑒別外，大都僅對個別特征成分進行含量測定與控制[7]。

本研究以痔寧片、痔康片、地榆槐角丸、槐角丸和槐花散5 種含槐花/米中成藥為對象，建立痔瘡治療相關黃酮類特征成分的HPLC 檢測方法，并結合對照品對照與Q-TOF/MS 進行了鑒定，可為含相同藥材的中藥制劑的質量控制研究提供參考[8]。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Shimadzu LC-2010CHT 和9030 Q-TOF/MS 液質聯用儀（日本Shimadzu 公司）；BS 21S 分析天平（德國Sartorius 公司）；KQ 5200DB 型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；PB-10 普及型pH 計（德國Sartorius 公司）

1.2 藥品與試劑

黃酮類7 種對照品：蘆丁對照品（含量：91.6%，批號：100080-202012）、黃芩苷對照品（含量：94.2%，批號：110715-202122）、山奈酚-3-O-蕓香苷對照品（含量：90.8%，批號：112007-201602）、水仙苷對照品（含量：93.1%，批號：111997-201501）、黃芩素對照品（含量：97.9%，批號：111595-201808）均來源于中國食品藥品檢定研究院；柚皮苷對照品（含量＞98%，批號：MUST-21032803，成都曼斯特生物科技有限公司）；新橙皮苷對照品（量＞98%，批號：RFSX01001908012，成都瑞芬思生物科技有限公司）。

甲醇、乙酸為分析純；乙腈為色譜純；自制超純水。

3 種中藥配方顆粒：炒槐花、麩炒枳殼、黃芩（含量：每克相當于10 g 飲片，批號：20210704）均由江蘇省中醫院配制、江陰天江藥業有限公司生產。槐米中藥飲片（批號：20210704）購于江蘇省中醫院。

痔寧片（規格：每片0.4 g；批號：2002007N，華潤三九（郴州）制藥公司）；痔康片（規格：每片0.3 g；批號：20061012，江中藥業）；地榆槐角丸（規格：每丸0.1 g；批號：19035278，北京同仁堂制藥廠）；槐角丸（規格：每丸0.05 g；批號：20040006，重慶桐君閣藥廠）；槐花散（規格：每袋5.6 g；批號：20 210422；永樂滋食品店）。

2 方 法

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

采用Agilent C8（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相A 為乙酸水溶液（pH=3.0），流動相B 為乙腈，梯度洗脫程序（A:B）：0 min（88:12）→25min（82:18）→45min（60:40）→46min（88:12）→50min（88:12）；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25 ℃；檢測波長為280 nm；進樣盤溫度25 ℃；進樣量10 μL。

理論板數按所測主成分峰計算均應不低于3000，分離度均應大于1.5，拖尾因子應在0.9～1.1。

2.2 質譜條件

電噴霧負離子檢測模式，接口電壓3.0 kV，離子源溫度300 ℃，霧化氣（氮氣）流速3.0 L·min-1，加熱氣（干空氣）和干燥氣（氮氣）流速均為10.0 L·min-1。質量數掃描范圍m/z 50～1000 Da。二級質譜掃描氬氣CID 能量范圍5.0～40 eV。

2.3 溶液配制

2.3.1 對照品溶液分別取蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、山奈酚-3-O-蕓香苷、水仙苷、黃芩素對照品各適量，精密稱定，置于同一量瓶，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得質量濃度依次約為80、20、10、20、10、10、10 μg·mL-1的混合定性對照品溶液。

分別取蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷的對照品適量，精密稱定，按照上述方法配制，制得質量濃度依次約為800、200、100、200 μg·mL-1的混合定量對照品溶液。

2.3.2 對照藥材溶液取槐米、炒槐花顆粒、麩炒枳殼顆粒、黃芩顆粒，研細，精密稱取適量，分別置于不同量瓶中，加適量甲醇，超聲提取30 min，放冷，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度分別約為500、500、200、100 μg·mL-1的溶液，分別濾過，取續濾液作為單一對照藥材溶液。

2.3.3 供試品溶液取痔寧片、痔康片各10 片，除去薄膜衣；或取地榆槐角丸、槐角丸各40 丸，剪碎，研細；或取槐花散，研細。按照上述單一對照藥材方法，配制質量濃度分別為2.4、1.5、2.0、2.0、2.0 mg·mL-1的供試品溶液。

3 結果

3.1 定性鑒定

分別取槐米、炒槐花、麩炒枳殼、黃芩等4 種單一對照藥材溶液、混合定性對照品溶液、痔寧片供試品溶液，按“2.1”色譜條件和“2.2”質譜條件進樣測定。

結果如圖1、圖2 和表2 所示。與對照藥材比較，確認痔寧片中含有分別與槐米、枳殼、黃芩藥材相關的黃酮類特征成分[9，10]，并進一步結合Q-TOF/MS 鑒定和對照品對照，確定痔寧片中黃酮類特征成分峰（編號1～8）依次為：蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香苷、水仙苷、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素（化學結構見圖3）。

表2 痔寧片中8 種黃酮類組分的Q-TOF/MS 液質聯用鑒定結果

圖1 痔寧片及對照溶液的典型色譜圖譜

圖2 痔寧片中Q-TOF/MS 鑒定的八種黃酮類成分的母離子和子離子質譜圖

圖3 痔寧片中8 種黃酮類成分的化學結構

3.2 定量方法

根據2020 版《中國藥典》第四部9101“藥品質量標準分析方法驗證指導原則”[7]，對痔寧片中相對含量較高的蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷進行定量分析方法學驗證，驗證指標主要包括專屬性、線性范圍、檢測限、定量限、準確度、精密度和耐用性。

3.2.1 專屬性分別取槐米、炒槐花、麩炒枳殼、黃芩顆粒溶液、混合對照品溶液、痔寧片供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。

結果顯示（圖1），蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷這4 種成分均分離良好，測定結果不受干擾，表明專屬性良好。

3.2.2 線性范圍精密量取混合定量對照品溶液適量，用50%甲醇定量稀釋制成相當于原液濃度：1%、2%、5%、10%、15%、20%、50%的系列混合對照品溶液。按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，以峰面積（Area）為縱坐標（Y），質量濃度C（μg·mL-1）為橫坐標（X），進行線性回歸。結果在系列濃度范圍內，4種成分均線性關系良好（r2均＞0.999）。見表3。

3.2.3 檢測限和定量限根據《中國藥典》2020 版通則9101 中“響應值標準偏差和標準曲線斜率法”分別計算檢測限和定量限。平行配制6 份定量限溶液，1 份檢測限溶液，依法進樣分析。結果顯示該方法靈敏度良好。見表3。

表3 痔寧片4 種黃酮類化合物HPLC-UV 測定的線性范圍和靈敏度

3.2.4 準確度和精密度取痔寧片粉末約24 mg，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，加入2 mL 甲醇超聲處理后，再精密添加混合定量對照品溶液0.5、1.0或1.5 mL，50%甲醇稀釋定容，即制得50%（低濃度）、100%（中濃度）、150%（高濃度）的加樣回收率試驗溶液，每個濃度各制備3 份；同時，不取痔寧片粉末，同法配制低、中、高濃度的對照品溶液；照“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄各組分峰面積。并根據外標標準曲線計算各成分的本底值、實測值和加樣回收率（%）及RSD%。見表4。

表4 痔寧片中四種黃酮類成分的回收率和精密度（n=3）

各組分的平均回收率在93%～99%，RSD%平均在0.6%～4.4%，表明該方法準確度和重復性良好。

3.2.5 耐用性通過改變流速、柱溫、pH 和不同色譜柱等條件，進樣測定。結果顯示，上述改變均能在一定條件下滿足系統適用性要求，方法可靠。

3.2.6 含量測定按照“2.3”項下方法配制供試品溶液和混合定量對照品溶液各2 份，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按對照品比較法計算5 種中藥制劑中4 個成分（蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、黃芩苷）的含量。

結果（圖4 和表5）與《中國藥典》標準（表1）相比，痔寧片和痔康片中蘆丁含量分別約為藥典標準的1.6 倍和2 倍；槐角丸中柚皮苷和黃芩苷量分別約為藥典標準的3.8 倍和1.5 倍。均滿足含量測定要求。另外，文獻[11，12]記載痔康片中每片蘆丁含量在6～8 mg，與本研究結果基本一致。

表5 五種含槐米/花痔瘡治療中成藥中黃酮類特征成分含量的HPLC 測定結果

圖4 5 種含槐米/花中成藥中黃酮類特征成分HPLC 測定典型色譜圖

4 討論

基于國內外藥典和文獻條件，建立了5 種痔瘡治療制劑的多指標同時定量方法并進行了方法學驗證。結果表明，該方法專屬性強、靈敏度適宜、線性范圍寬、準確可靠。以痔寧片為代表，對其特征黃酮類藥味成分同時采用對照品結合LC-PDA-QTOF/MS 鑒定，保障了5 種痔瘡治療制劑中多個黃酮類成分質量控制的可靠性。

槐花/米作為主要治療藥物的君藥，與黃芩、枳殼等共同配伍進行辯證治療。參考中藥質量標志物，以君臣佐使的組方原則，將蘆丁、黃芩苷、柚皮苷、新橙皮苷這4 種黃酮類化合物確定為其關鍵性指標成分，可以實現對這些復方中藥的質量控制。