氨磷汀對小鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用

潘 艷，黃烽如

1 江蘇醫藥職業學院 基礎醫學部，鹽城 224005；2 復旦大學附屬腫瘤醫院 藥劑科，上海 200032

缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，IRI）是指組織器官缺血缺氧，恢復血流供應后，則進一步加重組織器官損傷的病理生理過程[1]。在肝臟部分切除和肝移植等手術過程中，為了降低出血量，經常需要持續阻斷入肝血流，造成肝臟缺血再灌注損傷，這會增加術后肝功能衰竭發生率和圍手術期死亡風險[2]。故深入研究肝臟缺血再灌注損傷的發生機制，以及尋找降低肝臟缺血再灌注損傷的方法具有重要的臨床意義[3]。

氨磷汀是一種細胞保護劑，在臨床中主要用于降低放療和化療副作用[4]。最新研究顯示，氨磷汀在預防脊髓、腎臟、肺、心臟和腦等器官的缺血再灌注損傷中發揮著一定的保護作用[5，6]，但其是否能預防肝臟缺血再灌注損傷尚不清楚。本實驗的目的是研究氨磷汀預處理對小鼠肝臟缺血再灌注損傷的作用及其相關機制。

1 材料和方法

1.1 材料

30 只雄性C57BL/6 小鼠，體重18～20 g，由復旦大學附屬腫瘤醫院實驗動物中心提供；飼養在SPF級動物房內，造模前12 h 禁食，不禁水。

氨磷汀（阿米福汀）購于美羅藥業；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）測試盒和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST) 測試盒由南京建成生物工程研究所提供；TUNEL 凋亡診斷試劑盒購于Roche；多克隆兔抗小鼠抗體 Cytochrome C、Bcl -2、BAX、Caspase -3、GAPDH 和HRP 標記的山羊抗兔IgG 均由沈陽萬類生物技術公司提供。

1.2 方法

1.2.1 肝臟IRI 模型建立小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，劑量為50 mg·kg-1，采用腹部正中切口暴露小鼠肝臟，仔細分辨小鼠肝臟各葉，用棉簽游離第一肝門，找出支配肝臟左葉和中葉血管的共干，夾閉兩葉血管共干，使得肝左葉和中葉肝組織缺血，以實現70%肝臟組織缺血。肉眼觀察肝組織色澤變化，以確定造模是否成功；當肝臟組織由紅色變成白色時表明造模成功，臨時關閉腹腔，注意保溫，當缺血45 min 后松開血管夾，關閉腹腔，將小鼠放在保溫毯上等待其蘇醒。

1.2.2 實驗分組及具體步驟30 只雄性C57BL/6小鼠運用隨機化數字表分為3 組：假手術組、模型組和氨磷汀組；每組各10 只。假手術組：小鼠僅開腹，解剖肝門，不結扎血管，45 min 后關閉腹腔。模型組：小鼠只建立部分缺血再灌注損傷模型，不預處理。氨磷汀組：小鼠在建立部分缺血再灌注損傷模型15 min 前予尾靜脈注入劑量為400 mg·kg-1的氨磷汀預處理。當達到180 min 再灌注時間，麻醉3 組小鼠，取肝臟組織和血液，部分肝組織用4%多聚甲醛固定，部分肝組織液氮速凍，保存在-80 ℃冰箱里，血液離心后，取上清液血清保存于-80 ℃冰箱里。

1.2.3 轉氨酶檢測采用ALT 測定試劑盒和AST測定試劑盒分別檢測各組小鼠血清ALT 和AST 水平來評估肝細胞功能，根據試劑盒說明書進行操作，最后用酶標儀在510 nm 處測定各樣本數值，計算后得出各樣本ALT、AST 數值。

1.2.4 HE 染色在HE 染色過程中，石蠟組織切片大致經過脫蠟、脫水、染蘇木素、鹽酸酒精分化、染伊紅、透明和封片等步驟，在高倍鏡下（×400）隨機觀察。肝組織病理分析采用Suzuki 評分。Suzuki 評分含3 項：肝細胞壞死、肝竇淤血和細胞質空泡化；每項指標損傷程度由輕到重以0～4 分計。

1.2.5 TUNEL 染色根據TUNEL 凋亡診斷試劑盒（Roche）操作說明書，將石蠟切片進行染色。在高倍鏡下（×400）隨機觀察，每張片取5 個視野計數，計算平均值，計數肝細胞總數和TUNEL 陽性細胞總數。陽性比值=TUNEL 陽性細胞數/肝細胞總數。

1.2.6 免疫印跡技術提取各組肝組織總蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后煮沸5min，放入-20 ℃冰箱 保存。上樣前煮沸5 min，用10%SDS-PAGE 電泳分離蛋白，并轉移至聚偏二氟乙烯膜上進行電轉，轉膜結束后，室溫條件下在搖床上用5%脫脂奶粉封閉處理聚偏二氟乙烯膜2 h，加入多克隆兔抗小鼠抗體Cytochrome C、Bcl-2、BAX、Caspase-3 和GAPDH,稀釋比例均為1∶500。4 ℃過夜，用TBST 洗膜3 次后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG（稀釋比例為1∶3000），37 ℃反應1 h，再用TBST 洗膜3 次，于暗室內曝光成像。以GAPDH 為內參照，以目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值的比值計算目的蛋白的表達量。

1.2.7 統計分析采用SPSS 20.0 統計包和Graph-Pad Prism 5 進行統計分析。所有數據以均值±標準差（）表示。分析方法為單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。所有實驗均重復3 次。

2 結果

2.1 各組肝功能的比較

為了研究氨磷汀預處理對缺血再灌注損傷后肝功能的影響，采用血清ALT 和AST 來評估肝功能，結果如圖1 所示。假手術組ALT 和AST 數值分別為（51.60±8.72）IU·L-1和（95.74±14.25）IU·L-1；模型組分別為（792.12±69.74）和（970.71±130.08）IU·L-1；氨磷汀預處理組分別為（559.77±95.49）IU·L-1和（781.49±80.62）IU·L-1。模型組ALT 和AST 數值高于假手術組，而氨磷汀預處理組ALT 和AST 數值則低于模型組，差異均有統計學意義（P<0.05）。

圖1 各組小鼠血清ALT 和AST 的變化（，n=10）

2.2 各組肝組織病理變化的比較

為了研究氨磷汀預處理對缺血再灌注損傷后肝組織病理變化的影響，采用Suzuki 評分來評估肝組織病理變化，結果如圖2A、圖2C 所示。假手術組肝組織結構正常；模型組肝組織表現為肝竇充血、炎性細胞浸潤，許多肝細胞腫脹、空泡和壞死。與模型組相比，氨磷汀預處理組肝細胞空泡和壞死顯著減少。Suzuki 評分結果顯示，模型組評分高于假手術組，而氨磷汀預處理組評分低于模型組，差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.3 各組肝細胞凋亡情況的比較

為了研究氨磷汀預處理對缺血再灌注損傷后肝細胞凋亡情況的影響，采用TUNEL 染色評估肝細胞凋亡情況，結果如圖2B、圖2D 所示。假手術組、模型組、氨磷汀預處理組TUNEL 染色陽性細胞比值分別為2.73%±1.05%、60.77%±7.40%、41.92%±4.38%。假手術組基本上未見凋亡細胞，模型組出現大量凋亡細胞，氨磷汀預處理組凋亡細胞則較模型組減少；差異均具有統計學意義（P<0.05）。

圖2 各組小鼠肝組織HE 染色和TUNEL 染色（，n=10）

2.4 各 組Cytochrome C、Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白相對表達情況的比較

為了初步研究氨磷汀預處理抑制缺血再灌注損傷后肝細胞凋亡的分子機制，采用Western blotting 檢測Cytochrome C、Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白相對表達情況，結果如圖3 所示。與假手術組相比，模型組的Cytochrome C、Bax 和Caspase-3 蛋白表達均升高（P<0.05），而Bcl-2 蛋白表達降低（P<0.05）；氨磷汀預處理組的Cytochrome C、Bax 和Caspase-3 蛋白表達較模型組降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表達升高（P<0.05）。

圖3 各組Bcl-2、Bax、Caspase-3 和Cytochrome C 蛋白相對表達（，n=8）

3 討論

氨磷汀是一種無活性的化合物，被與細胞膜結合的堿性磷酸酶去磷酸后成為具有活性的代謝產物—WR-1065。當其進入細胞后，具有清除自由基、保護細胞膜和DNA 免受損傷的作用。目前氨磷汀是臨床上應用廣泛、效果確切的細胞保護劑[7]。在此通過阻斷小鼠70%血流入肝，成功構建了小鼠肝臟IRI 模型，并通過尾靜脈注入氨磷汀證實其可以降低肝臟缺血再灌注損傷。雖然之前的研究表明，氨磷汀可以減輕脊髓、腎臟、肺、心臟和腦等器官缺血再灌注損傷，但是本研究首次闡明了氨磷汀對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用以及潛在的分子機制。

缺血再灌注損傷的機制比較復雜，主要涉及氧化應激、細胞內鈣離子超載、線粒體能量障礙、細胞凋亡、細胞自噬和炎癥反應等多個方面[8]。大量研究證實，細胞凋亡是一種程序性死亡過程，在肝臟缺血再灌注損傷過程中起著重要的作用[9]。有實驗顯示，肝臟經過缺血再灌注后50%～70%的肝竇內皮細胞和40%～60%肝細胞出現凋亡[10]。本研究顯示，小鼠肝臟組織經過45 min 缺血180 min 再灌注后，約60%的肝細胞發生凋亡；但是經過氨磷汀預處理后，可以顯著降低缺血再灌注損傷誘導的肝細胞凋亡。

目前研究表明，多條途徑參與細胞凋亡[11]，比如線粒體途徑，細胞色素C 的釋放是此途徑的關鍵之一，線粒體膜破裂會釋放出細胞色素C（Cytochrome C）到細胞質中，與凋亡蛋白活化因子1 結合形成多聚體，該多聚體與凋亡起始分子caspase-9 結合形成凋亡小體，再激活下游的凋亡執行分子caspase-3等，進而啟動凋亡蛋白酶的級聯反應，最終誘導細胞凋亡[12]。本研究顯示，持續肝臟血流阻斷，細胞色素C 蛋白表達升高，而經過氨磷汀預處理后，細胞色素C 蛋白表達會降低，這說明氨磷汀預處理可以通過降低線粒體的損傷、抑制細胞色素C 的釋放，來阻止缺血再灌注對肝細胞的損傷。

除此之外，Bcl-2 家族也在線粒體途徑中發揮著重要的作用，包括抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl 和Bcl-w）和促凋亡蛋白（Bax、Bak）[13]。Wu SZ 等[5]研究發現，氨磷汀預處理可以減輕心臟缺血再灌注損傷，減少心肌細胞凋亡和心臟梗死面積，其保護機制主要通過提高Bcl2 蛋白表達、降低Bax 蛋白和caspase-3 蛋白表達，最終減少TUNEL 陽性細胞產生。Cheng H 等[6]在研究氨磷汀預防腦缺血再灌注損傷的實驗中發現，氨磷汀預處理可通過下調Bax、caspase-9 和caspase-3 蛋白表達，以及上調Bcl-2蛋白表達，來抑制缺血再灌注損傷誘導的神經細胞凋亡。本研究構建的肝臟缺血再灌注損傷模型實驗表明，氨磷汀預處理可以通過提高Bcl-2 蛋白表達和降低Bax，Caspase-3 蛋白表達等機制來減輕缺血再灌注對肝細胞的損傷。

綜上所述，本實驗顯示，氨磷汀可以阻止缺血再灌注損傷誘導的Cytochrome C 的釋放，上調Bcl-2 蛋白表達和下調Bax 蛋白表達，最終通過抑制肝細胞凋亡來減輕肝臟缺血再灌注損傷。