氧化苦參堿通過上調miR-485-5p的表達抑制宮頸癌細胞的增殖研究

鐵煒煒，葛芬芬

宮頸癌的臨床治療以手術為主，但是腫瘤的復發率及轉移率一直居高不下，難以防范[1]。因此，如何快速尋找到該疾病治療與轉移的分子標記和靶點至關重要，為其早期診斷及治療提供相應的參考依據。miRNA是一類長度為單鏈的非編碼微小RNA，其穩定性高度遺

傳，主要通過其下游靶基因調控腫瘤的發生及發展[2]。有研究發現miR-485-5p的表達與多種惡性腫瘤有關，其可以作為抑癌基因參與腫瘤的侵襲轉移過程中[3-5]，但其在宮頸癌組織中的表達情況目前研究報道較少。本研究主要探討宮頸癌組織中miR-485-5p的表達情況，從miRNAs的角度研究氧化苦參堿對宮頸癌細胞增殖的影響及其作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 實驗儀器：熒光定量PCR儀（Roche480，羅氏診斷有限公司，德國）；多功能酶標儀（美國BIO-RAD公司）；CO2培養箱（英國RS Biotech公司）；光學顯微鏡（德國Leica公司）；恒溫水浴箱（上海精宏實驗設備有限公司）；超凈工作臺（天津凈化儀器廠）。實驗試劑：氧化苦參堿（中國食品藥品檢定研究院，批號120609-202114）；DMEM培養基（美國Gibco公司，批號21225155）；MTT（美國Solarbio公司，批號M8219）；雙熒光素酶檢測試劑盒（美國Promega公司，批號9FB325）；反轉錄試劑盒（美國Thermo公司，批號K1654）；Cyclin D1多克隆抗體（武漢博士德）。胎牛血清培養基（美國Sciencell公司，批號0507）。實驗菌株：實驗組為人宮頸鱗癌細胞株Siha（HPV 16+）（武漢博士德生物工程有限公司）；對照組為正常宮頸上皮組織細胞，收集于2021年1—5月寧波市醫療中心李惠利醫院子宮肌瘤摘除的新鮮子宮組織常規培養后所得。

1.2 方法

1.2.1 最適藥物濃度檢測 將Siha（HPV16+）細胞以5×103/ml接種到96孔板中，每孔加入100 l含有10%胎牛血清的培養基，24 h后觀察細胞狀態，同時加入不同濃度的氧化苦參堿（5、25、50、100、200 mol/L），同時設立空白對照。反應24 h后，每孔加入50 l MTT液繼續反應2 h，酶標儀檢測490 nm處每孔的吸光度，每孔重復測3次。

1.2.2 miRNAs表達量的檢測 培養Siha（HPV16+）細胞系，提取各細胞的總RNA，逆轉錄后應用Real-Time PCR分別檢測各細胞內mi R-126、mi R-485-5p及miR-30a的表達量，每孔重復測3次。

1.2.3 宮頸癌細胞株及宮頸上皮組織中Cyclin D1的表達檢測 培養Siha（HPV 16+）細胞，收集細胞后，提取總蛋白，等量上樣，SDS-PAGE電泳分離后轉膜，封閉后分別孵育一抗、二抗，ECL發光檢測，分析Cyclin D1的相對表達量，同時檢測蛋白的灰度值。

1.3 統計方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，采用 檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 最適藥物濃度檢測結果 通過MTT的實驗結果顯示，在100 mol/L濃度時，其吸光度值最小，此濃度下對細胞的抑制效果最佳，故將此濃度設為最佳濃度，供后續實驗使用。見封四彩圖2。

2.2 兩組miRNAs表達情況比較 實驗組miR-485-5p表達水平明顯下調，而兩組miR-126及miR-30a表達水平差異均無統計學意義（均＞0.05），見表1。

表1 兩組miRNAs表達情況比較

2.3 miR-485-5p的表達水平 與對照組相比，氧化苦參堿刺激細胞后，miR-485-5p的表達水平上調，miR-485-5p mimics轉染細胞后，miR-485-5p明顯升高，且升高幅度大于氧化苦參堿刺激后的水平；用miR-485-5p inhibitor轉染細胞后，miR-485-5p表達量下調。見封四彩圖3。

2.4 宮頸癌細胞株及宮頸上皮組織中Cyclin D1的表達結果 Western blot結果顯示氧化苦參堿或miR-485-5p mimics處理人宮頸鱗癌細胞株Siha（HPV 16+）細胞后，Cyclin D1蛋白的條帶變淡；mi R-485-5p inhibitor轉染細胞后，Cyclin D1蛋白條帶加深。

3 討論

臨床研究發現宮頸癌病變可能與患者的HPV感染、多孕及多產等多種因素密切相關[6]，且研究發現宮頸癌組織中多存在多種基因的過表達情況[7]。相關研究在宮頸癌細胞株Siha上檢測miRNA221的表達，研究其與腫瘤細胞侵襲轉移行為間的關系，結果發現miRNA221在宮頸癌細胞株Siha中扮演促癌因子的作用。因此本研究先將不同濃度的氧化苦參堿作用于宮頸鱗癌細胞株Siha（HPV16+），應用MTT檢測細胞的增殖情況，篩選最佳藥物濃度。結果發現在100 mol/L濃度時吸光度最低，說明氧化苦參堿對Siha（HPV16+）細胞株增值具有明顯的抑制作用，而且在100 mol/L濃度時細胞被抑制的程度接近最大值，因此將100 mol/L設為最適濃度，作為后續實驗的處理濃度。

有研究發現Cyclin D1蛋白對患者體內的細胞周期具有一定的調節作用，其可以對腫瘤細胞的分化、增殖產生促進作用，延緩患者腫瘤細胞凋亡進程[8]，進而對患者體內癌細胞的轉移起到促進作用，導致患者的病情快速發展。宮頸癌患者腫瘤組織內多存在Pin1和Cyclin D1過表達現象，對腫瘤細胞的分化增殖具有重要作用[9]。有研究結果顯示苦參堿對腫瘤的抵抗效果較為明顯[10]，苦參堿由中藥苦參中提取的一種具有抗炎及抗病毒作用的生物堿。而大量研究顯示，苦參堿具有良好的抗腫瘤作用[11]；還有研究發現其除了上述作用外還具有抑制腫瘤細胞的轉移，并加速腫瘤細胞凋亡的作用[12]。苦參堿對腫瘤的臨床治療效果較為顯著，但關于其作用機制研究較少。因此本研究觀察了苦參堿對宮頸癌細胞株和宮頸上皮組織中Cyclin D1表達的影響，以期對宮頸癌的臨床治療起到幫助。

本研究結果顯示氧化苦參堿或miR-485-5p mimics處理人宮頸鱗癌細胞株Siha（HPV 16+）細胞后，Cyclin D1蛋白的條帶變淡；miR-485-5p inhibitor轉染細胞后，Cyclin D1蛋白條帶加深。這說明氧化苦參堿處理宮頸癌菌株后可以抑制Cyclin D1表達，進而可以抑制宮頸癌細胞的增殖。臨床研究發現miRNAs對基因的轉錄后表達調控具有極其重要的作用。目前隨著研究的進一步深入，已經在人體中發現了接近700多種miRNAs，miRNAs主要是參與人體內的基因表達過程，但是關于其作用的機制目前尚不明確。相關研究發現在人體惡性腫瘤的發生及發展與miRNAs的異常調控具有一定的關聯性[13-14]，已經在乳腺癌、前列腺癌及肝癌等多種腫瘤中發現了miRNAs的異常表達[15-16]。本研究結果顯示實驗組中miR-485-5p在Siha（HPV16+）細胞中呈明顯下調，而miR-126及miR-30a的表達無明顯差異。這說明miR-485-5p的表達下降跟宮頸癌細胞的增值有關，使用氧化苦參堿處理后miR-485-5p的表達有所上升，說明氧化苦參堿可以通過上調miR-485-5p表達進而抑制宮頸癌細胞的增值。