美金剛對(duì)老齡小鼠術(shù)后認(rèn)知功能和焦慮抑郁情緒的影響

王小明，張立新，習(xí)建華

美金剛胺是一種N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）拮抗劑，大量研究證實(shí)其可改善阿爾茨海默氏病（AD）模型動(dòng)物的認(rèn)知功能[1-2]，臨床試驗(yàn)也支持其用于治療中、重度AD[3-4]。研究表明，術(shù)后認(rèn)知功能紊亂（PND）動(dòng)物的海馬中同樣能夠觀察到Tau蛋白磷酸化和-淀粉樣蛋白沉積[5-6]，提示PND具有與AD相似的發(fā)病機(jī)制。此外，術(shù)后疼痛、睡眠剝奪和心理因素等常導(dǎo)致患者出現(xiàn)焦慮、抑郁情緒，而動(dòng)物和臨床研究均提示了美金剛胺良好的抗抑郁、抗焦慮作用。本研究使用老齡小鼠進(jìn)行腹腔探查手術(shù)以建立PND動(dòng)物模型，聯(lián)合使用多種認(rèn)知和情緒行為學(xué)方法，觀察美金剛對(duì)老齡小鼠術(shù)后認(rèn)知功能和焦慮抑郁情緒的影響。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 本研究獲得寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（AEWC-2018-12）。12～14個(gè)月齡雄性清潔級(jí)ICR小鼠30只，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將動(dòng)物隨機(jī)分為3組（n=10）：假手術(shù)組（F組），小鼠接受安慰劑治療4周，然后進(jìn)行假手術(shù)；手術(shù)組（S組），接受安慰劑治療4周，然后進(jìn)行剖腹手術(shù)；實(shí)驗(yàn)組（A組），接受鹽酸美金剛治療4周，然后進(jìn)行腹腔探查手術(shù)。

1.2 麻醉方法與圍術(shù)期管理 采用七氟烷小動(dòng)物麻醉機(jī)（瑞沃德公司，深圳），七氟烷濃度調(diào)節(jié)至3%，將小鼠放入誘導(dǎo)箱內(nèi)進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)，直至小鼠入睡，翻正反射消失。麻醉維持期，小鼠通過(guò)面罩持續(xù)吸入2%七氟烷，控制麻醉維持時(shí)間為0.5 h。

1.3 腹腔探查模型 于右肋下垂直于肋骨做一縱行切口，長(zhǎng)約1 cm，切口深至腹腔內(nèi)。戴有無(wú)菌外科手套的手指伸入腹腔內(nèi)進(jìn)行探查約30 s，取出約10 cm的小腸至腹腔外，進(jìn)行摩擦約30 s，反復(fù)該操作3次。用消毒器械和外科縫合線縫合傷口，切口處以0.5%羅哌卡因浸潤(rùn)鎮(zhèn)痛并涂抹紅霉素預(yù)防感染。整個(gè)麻醉手術(shù)過(guò)程控制在15 min內(nèi)，結(jié)束麻醉后待小鼠自然清醒。假手術(shù)組小鼠接受同樣時(shí)長(zhǎng)的麻醉而不進(jìn)行手術(shù)。

1.4 行為學(xué)測(cè)試 術(shù)后第7天開(kāi)始行為學(xué)測(cè)試，根據(jù)應(yīng)激程度的大小，實(shí)驗(yàn)順序?yàn)樾挛矬w識(shí)別實(shí)驗(yàn)（NOR）、高架十字迷宮測(cè)試、懸尾實(shí)驗(yàn)和條件性恐懼實(shí)驗(yàn)（FC），見(jiàn)封三彩圖1。

1.4.1 NOR 第1天，將A、B兩相同物體放入曠場(chǎng)箱內(nèi)，讓小鼠進(jìn)行探索、訓(xùn)練5 min；第2天，將B物體換為不同形狀、質(zhì)地的物體C，記錄小鼠5 min內(nèi)對(duì)兩物體的探索時(shí)間（T），并計(jì)算辨別指數(shù)（RI）=TC/（TA+TC）。

1.4.2 高架十字迷宮測(cè)試 高架十字迷宮由兩條開(kāi)臂和兩條閉臂組成，互相垂直呈十字交叉，臂寬5cm，臂長(zhǎng)35cm，閉臂高15cm，迷宮離地高度55cm。將小鼠面對(duì)閉臂放置于十字迷宮的中央正方形內(nèi)，讓其自由探索10min。進(jìn)入開(kāi)臂或閉臂的定義是四肢均進(jìn)入該臂，記錄開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)和開(kāi)臂停留時(shí)間。焦慮樣行為表現(xiàn)為進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)減少以及在開(kāi)臂上停留的時(shí)間減少。

1.4.3 懸尾實(shí)驗(yàn) 矩形盒子的頂部放置一懸掛桿用于懸掛小鼠的尾巴。用一條粘性膠帶粘貼在尾巴的末端，將小鼠懸掛在盒子的中間持續(xù)6 min。小鼠鼻子與儀器底板之間的距離為15 cm。記錄每只小鼠靜止不動(dòng)的時(shí)間。缺乏與逃逸相關(guān)的行為被認(rèn)為是靜止不動(dòng)，反映抑郁樣行為。逃逸相關(guān)的行為包括試圖攀爬懸掛桿，身體強(qiáng)烈晃動(dòng)以及四肢運(yùn)動(dòng)。僅限于前腿但沒(méi)有后腿牽扯的小動(dòng)作不算作活動(dòng)。

1.4.4 FC 小鼠在無(wú)聲黑暗試驗(yàn)箱內(nèi)適應(yīng)3 min后，給予單一高頻聲音（30 s，70 dB，3 kHz）刺激，隨后給予足底電擊（2 s，0.7 mA）刺激，刺激結(jié)束后恢復(fù)30 s，循環(huán)2次后放回飼養(yǎng)籠。訓(xùn)練結(jié)束后24 h，將小鼠再次放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)自由探索3 min，不給予任何刺激，記錄場(chǎng)景誘發(fā)僵直，主要反映海馬依賴(lài)性恐懼記憶；2 h后放入改造后實(shí)驗(yàn)箱（白色分隔板遮住通電柵欄，改變四周箱壁顏色），自由探索3 min后，給予上述相同聲音刺激3 min，記錄線索誘發(fā)僵直，主要反映非海馬依賴(lài)性恐懼記憶。

1.5 美金剛給藥 A組小鼠每天管飼法給予美金剛鹽酸鹽（Lundbeck公司，丹麥）20 mg/kg[1]，持續(xù)4周。F組和S組通過(guò)管飼法給予等體積0.9%氯化鈉注射液，同樣持續(xù)4周。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)分析和作圖采用Graphpad prism 7.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，bonferroni法行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOR實(shí)驗(yàn) 3組小鼠RI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.42，P＜0.01），S組RI低于F組（t=3.84，P＜0.01），A組與S組的RI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.16，P＞0.05）。見(jiàn)封三彩圖2a。

2.2 懸尾實(shí)驗(yàn) 3組小鼠不動(dòng)時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.39，P＜0.01），S組不動(dòng)時(shí)間大于F組（t=6.76，P＜0.01），A組不動(dòng)時(shí)間小于S組（t=4.90，P＜0.01）。見(jiàn)封三彩圖2b。

2.3 高架十字迷宮測(cè)試 3組小鼠開(kāi)臂停留時(shí)間和開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.85、66.32，均P＜0.01）。S組開(kāi)臂停留時(shí)間短于F組（t=7.05，P＜0.01），A組開(kāi)臂停留時(shí)間長(zhǎng)于S組（t=3.54，P＜0.01）。S組開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)少于F組（t=11.45，P＜0.01），A組開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)多于S組（t=4.67，P＜0.01）。見(jiàn)封三彩圖2c、d。

2.4 FC實(shí)驗(yàn) 3組小鼠場(chǎng)景誘發(fā)僵直時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.22，P＜0.01），S組的僵直時(shí)間低于F組（t=3.87，P＜0.01），A組的僵直時(shí)間高于S組（t=3.00，P＜0.05）。3組小鼠的線索誘發(fā)僵直時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.49，P＜0.01），S組的僵直時(shí)間低于F組（t=3.22，P＜0.01），A組僵直時(shí)間高于S組（t=3.47，P＜0.01）。見(jiàn)封三彩圖2e、f。

3 討論

基于中樞神經(jīng)炎癥是PND發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，藥物領(lǐng)域的研究主要集中于抗炎藥物，如小劑量氯胺酮的抗炎作用[7]、米諾環(huán)素對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制作用[8]以及非甾體類(lèi)抗炎藥物[9]等。本研究發(fā)現(xiàn)可有效治療AD的NMDAR拮抗劑美金剛對(duì)術(shù)后認(rèn)知功能同樣具有保護(hù)性作用。本研究選擇了NOR實(shí)驗(yàn)和FC實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估小鼠的認(rèn)知功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，美金剛能夠有效緩解手術(shù)創(chuàng)傷所致的小鼠恐懼記憶障礙，但是并不能改善物體識(shí)別記憶。筆者認(rèn)為，手術(shù)創(chuàng)傷影響的認(rèn)知功能涉及多個(gè)方面，累及的相關(guān)腦區(qū)也存在差異性。美金剛的作用靶點(diǎn)可能不包括編碼物體識(shí)別記憶的相關(guān)腦區(qū)。

研究表明，中樞神經(jīng)炎癥也可導(dǎo)致神經(jīng)退行性改變，如Tau蛋白的過(guò)度磷酸化，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的谷氨酸興奮毒性以及-淀粉樣蛋白沉積[5-6]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中促炎細(xì)胞因子的釋放導(dǎo)致谷氨酸水平上調(diào)和NMDAR活性的增加，在病理狀態(tài)下Ca2+通過(guò)離子通道大量流入從而導(dǎo)致NMDARs過(guò)度興奮，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。此外，NMDARs的過(guò)度活化也與Tau毒性有關(guān)[10]。上述過(guò)程是AD和PND發(fā)生、發(fā)展的共同分子機(jī)制[5]。雖然尚無(wú)直接證據(jù)，筆者推測(cè)美金剛可能是通過(guò)阻斷Ca2+離子通道抑制NMDAR介導(dǎo)的谷氨酸能興奮性毒性和Tau蛋白磷酸化，從而減輕手術(shù)創(chuàng)傷所致的認(rèn)知功能減退。

術(shù)后認(rèn)知功能的臨床研究和基礎(chǔ)研究之間存在著“鴻溝”[11]。臨床研究中對(duì)于PND的診斷通常采用多維度多種類(lèi)的評(píng)估量表，對(duì)患者的記憶力、注意力、執(zhí)行力、語(yǔ)言理解能力和信息處理等多方面的認(rèn)知和記憶能力進(jìn)行綜合評(píng)估[12-13]。但是利用動(dòng)物模型進(jìn)行的臨床前基礎(chǔ)研究大多集中于海馬依賴(lài)的學(xué)習(xí)記憶，而忽視了認(rèn)知的其他方面。鑒于外科手術(shù)后伴隨的疼痛、引流管不適、睡眠剝奪等不良因素常導(dǎo)致患者出現(xiàn)不同程度的焦慮和抑郁情緒，因此本研究通過(guò)高架十字迷宮和懸尾實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠的焦慮抑郁情緒。研究結(jié)果顯示，腹腔探查術(shù)后7 d，小鼠表現(xiàn)出顯著的焦慮、抑郁樣行為。先前研究證實(shí)了競(jìng)爭(zhēng)性NMDAR拮抗劑的抗焦慮作用相比苯二氮卓類(lèi)藥物或巴比妥類(lèi)藥物更為有效[14]。針對(duì)美金剛的動(dòng)物和臨床研究均提示了美金剛胺良好的抗抑郁、抗焦慮作用[15-16]。本研究中美金剛對(duì)于小鼠腹腔探查手術(shù)所誘導(dǎo)的焦慮抑郁情緒同樣具有有效的抑制作用。然而，目前尚缺乏臨床證據(jù)支持美金剛對(duì)PND患者情緒方面的緩解作用，值得進(jìn)一步探討和研究。

綜上所述，美金剛能夠改善老齡小鼠手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的認(rèn)知功能減退和焦慮、抑郁情緒。