核受體結(jié)合SET域蛋白1催化活性區(qū)域B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位的預(yù)測(cè)與分析

陳旭東

組蛋白賴氨酸甲基化酶（HMTases）可以催化組蛋白的甲基化，參與多種生物學(xué)事件，對(duì)DNA復(fù)制、DNA損傷應(yīng)激、細(xì)胞周期循環(huán)、胞質(zhì)分離及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等多方面有重要作用[1]。HMTases可以特異性地將甲基從s-腺苷甲硫氨酸（AdoMet）轉(zhuǎn)移到組蛋白末端的幾個(gè)特定的賴氨酸[2]。核受體結(jié)合SET域蛋白家族（NSDs）是HMTases中的一支亞家族，包括NSD1、NSD2（MMSET/WHSC1）和NSD3（WHSC1L1），都包含具有催化活性的SET結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域高度保守[3]。NSD1、NSD2及NSD3在小鼠發(fā)育中是必須的，敲除NSD1及NSD2的基因會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡[4]。研究表明，NSDs的突變和擴(kuò)增與多種發(fā)育異常疾病和腫瘤相關(guān)[5-6]。NSD1的SET結(jié)構(gòu)域可以特異性地催化H3K36[7]。NSD1的異常表達(dá)及活性改變和多種腫瘤有關(guān)。現(xiàn)已有多項(xiàng)研究以甲基化酶為靶標(biāo)，開發(fā)抑制藥物，以期待治療相應(yīng)的疾病[8-9]。本研究擬預(yù)測(cè)NSD1催化活性區(qū)域（NSD1-CD）的B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位，來為應(yīng)用多肽小片段制備單克隆抗體、表位疫苗及研究其蛋白功能提供重要的依據(jù)。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 NSD1-CD段氨基酸序列的獲取 NSD1全長(zhǎng)氨基酸序列檢索于uniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/），NSD1-CD段的范圍參考Qiao等[10]研究。

1.2 NSD1-CD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)獲取 自PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）獲取NSD1-CD（PDB ID 300I）的三級(jí)結(jié)構(gòu)，使用蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)詞典DSSP（Definition of Secondary Structure of Proteins，DSSP）獲取其二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3 NSD1-CD蛋白親水性、極性、抗原性和表面可及性的預(yù)測(cè) 利用EXPASY服務(wù)器提供的親水性參數(shù)（Hopp&Woods）、極性參數(shù)（Zimmerman）和DNAstar軟件的Protein進(jìn)行的表面可及性參數(shù)（Emini）、抗原性參數(shù)（Jameson-Wolf）和柔韌性參數(shù)（Karplus-Schulz）方法來對(duì)NSD1-CD蛋白B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4 綜合分析 綜合以上預(yù)測(cè)方法，兼顧各項(xiàng)預(yù)測(cè)參數(shù)推斷NSD1蛋白B細(xì)胞表位，采用吳玉章等[11]建立的抗原性指數(shù)（AI）綜合評(píng)判NSD1-CD B細(xì)胞表位的優(yōu)勢(shì)區(qū)域。

1.5 結(jié)合蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 在PYMOL軟件上標(biāo)出優(yōu)勢(shì)表位在NSD1-CD上的位置，在uniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站上通過Structure模塊的Toggle controls panel工具進(jìn)行測(cè)距。

2 結(jié)果

2.1 NSD1-CD的氨基酸序列 NSD1全長(zhǎng)為2 696個(gè)氨基酸（長(zhǎng)型），相對(duì)分子質(zhì)量為296.65 kDa。NSD1-CD的范圍是1 852～2 082，其中包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域：PRE-SET（AWS）1 890～1 940，SET 1 942～2 059，POST-SET 2 066～2 082；長(zhǎng)為231個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為26.53 kDa，具體序列如下：KELRQLQEDRKNDKKPPPYKHIKVNRPIGRVQIFTADLSEIPRCNCKATDENPCGIDSECINRMLLYECHPTVCPAGGRCQNQCFSKRQYPEVEIFRTLQRGWGLRTKTDIKKGEFVNEYVGELIDEEECRARIRYAQEHDITNFYMLTLDKDRIIDAGPKGNYARFMNHCCQPNCETQKWSVNGDTRVGLFALSDIKAGTELTFNYNLECLGNGKTVCKCGAPNCSGFLG。

2.2 NSD1-CD的二級(jí)結(jié)構(gòu) 自PDB獲取NSD1-CD的三級(jí)結(jié)構(gòu)，使用蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)詞典DSSP獲取其二級(jí)結(jié)構(gòu)，提示NSD1-CD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中以無規(guī)卷曲為主-螺旋、-轉(zhuǎn)角相對(duì)較少。可見無規(guī)則卷曲主要位于NSD1全長(zhǎng)N端的1 865～1 870、1 879～1 887、1 893～1 910、1 917～1 926、1 940～1 943、1 949～1 953、1 959～1 966、1 992～1 997、2 022～2 026、2 045～2054及2 057～2082。見封二彩圖1和表1。

表1 NSD1-CD的二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)成比 例（%）

2.3 多參數(shù)預(yù)測(cè)NSD1-CD蛋白表位 按照Hopp＆ Woods、Zimmerman、Jameson-Wolf、Karplus-Schulz及Emini方案分別預(yù)測(cè)NSD1-CD蛋白的親水性、極性、抗原性、柔韌性和表面可及性。其中高于閾值的肽段即為預(yù)測(cè)的抗原表位（抗原指數(shù)≥0，親水性指數(shù)≥0，表面可及性指數(shù)≥1，極性指數(shù)≥12）。綜合分析NSD1-CD的親水性、極性、柔韌性、表面可及性和抗原性顯示：應(yīng)用不同參數(shù)預(yù)測(cè)的B細(xì)胞抗原表位肽段略有差異，但位于N端的1 856～1 870，1 900～1 902，1 938～1 942，1 957～1 964在多種預(yù)測(cè)方法中一致。見封二彩圖2和表2。

表2 NSD1-CD親水性、極性、柔韌性、抗原性、表面可及性等參數(shù)的預(yù)測(cè)結(jié)果

2.4 NSD1-CD蛋白表位的綜合預(yù)測(cè) 綜合以上預(yù)測(cè)方法及AI計(jì)算方法，計(jì)算NSD1-CD的B細(xì)胞表位平均AI，結(jié)果顯示人NSD1-CD的1 865～1 869、1 959～1 964平均AI較高，提示其可能為B細(xì)胞表位的優(yōu)勢(shì)區(qū)域。見表3。

表3 NSD1-CD B細(xì)胞表位的平均抗原性指數(shù)

2.5 結(jié)合蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 自PDB獲取NSD1-CD（PDB ID 300I）的三級(jí)結(jié)構(gòu)文件，通過PYMOL標(biāo)記出SET結(jié)構(gòu)域和優(yōu)勢(shì)表位的位置，可見SET結(jié)構(gòu)域形成了一個(gè)“口袋”狀結(jié)構(gòu)，口袋中即為其活性區(qū)域，內(nèi)側(cè)可容納一個(gè)AdoMet，可催化其轉(zhuǎn)移甲基至組蛋白上。優(yōu)勢(shì)表位KTDIKK（1 959～1 964）位于SET結(jié)構(gòu)域上，但位于“口袋”的外側(cè)底部，距離活性區(qū)域較遠(yuǎn)（封二彩圖3a）。而優(yōu)勢(shì)表位KKPPP（1 865～1 869）位于PRE-SET（AWS）上，在“口袋”的“口”附近（封二彩圖3b）。在uniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站上通過Structure模塊的Toggle controls panel工具進(jìn)行測(cè)距，測(cè)量1 961號(hào)天冬氨酸（位于優(yōu)勢(shì)表位KTDIKK的中央）和AdoMet的距離，結(jié)果為24.22?（封二彩圖4a），測(cè)量1 867號(hào)脯氨酸（位于優(yōu)勢(shì)表位KKPPP的中央）和AdoMet的距離，結(jié)果為13.25?（封二彩圖4b）。

3 討論

使用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位是現(xiàn)如今廣泛使用且高效方便的方法[12-13]，目前有多種B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)方法，但由于各種方法的差異性及局限性，不同方法預(yù)測(cè)的表位差異較大，故研究人員正不斷地改進(jìn)與完善預(yù)測(cè)評(píng)價(jià)體系，使B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)、評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化。目前得到公認(rèn)的具有較好預(yù)測(cè)結(jié)果的方法有二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、抗原性、表面可及性等參數(shù)的預(yù)測(cè)，本研究將以上參數(shù)與吳玉章等[11]建立的AI相結(jié)合，從而初步地做出科學(xué)、合理的預(yù)測(cè)分析。

由于NSD-1蛋白的甲基轉(zhuǎn)移活性主要是通過SET結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)的，本研究通過截取其中的一部分（NSD-CD），包括包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域（PRE-SET 1 890～1940，SET1 942～2 059，POST-SET2066～2082），從而減少預(yù)測(cè)的難度。用多種方法對(duì)其B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，最終得到了2段優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位，分別位于N端的1 865～1 869及1 959～1 964，其中優(yōu)勢(shì)表位KTDIKK（1 959～1 964）位于SET結(jié)構(gòu)域上，但是距離AdoMet所在的活性區(qū)域較遠(yuǎn)，1 961號(hào)天冬氨酸（位于優(yōu)勢(shì)表位KTDIKK的中央）和Ado-Met的距離為24.22?，影響其活性的可能性較小；而優(yōu)勢(shì)表位KKPPP（1 865～1 869）位于PRE-SET（AWS）上，且距離AdoMet所在的活性區(qū)域較近，在uniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站上通過Structure模塊的Toggle controls panel工具進(jìn)行測(cè)距，測(cè)量1 867號(hào)脯氨酸（位于優(yōu)勢(shì)表位KKPPP的中央）和AdoMet的距離，結(jié)果為13.25?，對(duì)SET結(jié)構(gòu)域的甲基轉(zhuǎn)移活性有影響的可能性較大。

在Qiao等[10]的研究中，POST-SET結(jié)構(gòu)域如同一個(gè)“蓋子”，覆蓋在SET結(jié)構(gòu)域的活性區(qū)域表面，被認(rèn)為對(duì)其活性有重要作用，具有作為藥物靶點(diǎn)的可能。但本研究顯示POST-SET段親水性及表面可及性較弱，難以預(yù)測(cè)出優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位。本研究成功預(yù)測(cè)了NSD1的B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位，為應(yīng)用多肽小片段制備單克隆抗體、表位疫苗及研究其蛋白功能提供重要的依據(jù)。