延遲放瓶對2種自動化血培養系統苛養菌培養的影響

褚敏君， 李小娟， 黃海林， 李 玨， 麻明彪， 杜廷義， 王海平

（昆明市兒童醫院 昆明醫科大學附屬兒童醫院檢驗科，云南 昆明 650228）

血流感染（bloodstream infection，BSI）是一種病死率極高的全身感染性疾病[1]，快速、準確地檢出血液中的病原菌，可有效降低病死率，提高治愈率。在臨床工作中，因各種原因常常不能及時將血培養瓶放入培養系統中，延遲放瓶現象較為普遍。針對延遲放瓶對血培養陽性檢出情況的影響，本研究選取肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）和流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）這2種兒童感染常見的苛養菌，制備不同濃度含菌血液模擬樣本，比較其室溫放置不同時間后，在2種自動化血培養系統中的陽性檢出情況。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

標準菌株肺炎鏈球菌（ATCC 49619）和流感嗜血桿菌（ATCC 9007）購自國家衛生健康委臨床檢驗中心。

1.2 儀器與試劑

BACTEC FX血培養儀及配套中和兒童抗菌藥物需氧瓶BactecPeds Plus（美國BD公司）。BACT/ALERT 3D血培養儀及配套兒童中和抗菌藥物需氧瓶 BacT/ALERT PF（法國生物梅里埃公司）。無菌血液來自身體健康未使用過抗菌藥物的獻血者。

1.3 方法

用無菌0.9% NaCl溶液將標準菌株配制成1×102、1×103和1×105CFU/mL的菌懸液備用，通過菌落計數確證菌懸液濃度。在每個血培養瓶中均注入5 mL無菌全血，再加入1 mL配制的菌懸液混勻，每份樣本重復配制3瓶。將含不同濃度菌懸液的血培養瓶分別在室溫（22 ℃）中放置0、8、16和24 h后，分別放入BACT/ALERT 3D血培養儀和BACTEC FX血培養儀中。培養儀的預設培養時間為5 d，若5 d后系統仍未報陽，則為培養陰性。報陽樣本報陽時間為3瓶的平均值。抽取所有培養瓶內液體，轉種后進行菌種鑒定，以確認生長菌為接種菌，且未被污染。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行數據分析。采用重復測量方差分析評價受試者內因素（不同的血培養系統、延遲放瓶時間和菌液濃度）對因變量（細菌報陽時間）的影響。采用Mauchly球對稱假設檢驗分析受試者內因素的交互作用；對不滿足球對稱假設的數據，采用Greenhouse-Geisser計算球對稱系數ε，校正結果。呈正態分布的計量資料以x±s表示，2組之間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析結合Bonferroni校正。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 培養結果

不同濃度肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌接種瓶經室溫放置不同時間后，在2種血培養儀中均自動檢出陽性。報陽時間見表1。

表1 不同延遲放瓶時間2種苛養菌不同血培養儀平均報陽時間 h

2.2 不同因素及其交互效應對報陽時間的影響

BACTEC FX血培養系統報陽時間短于BACT/ALERT 3D血培養系統，報陽時間隨延遲放瓶時間的增加呈延長趨勢，隨菌液濃度的增高呈縮短趨勢（P＜0.001）。肺炎鏈球菌延遲放瓶0 h的報陽時間與8、16、24 h比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；流感嗜血桿菌延遲放瓶0 h的報陽時間與8、24 h比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同因素及其交互效應對苛養菌報陽時間的影響

3 討論

作為診斷BSI的金標準，血培養在臨床工作中發揮著重要作用。提高血培養陽性檢出率、縮短檢測時間，一直是臨床微生物實驗室努力的目標。血培養陽性結果的正確與否受樣本、儀器、檢測原理等多種因素的影響[2]。BACTEC FX血培養系統和BACT/ALERT 3D血培養系統是目前臨床微生物實驗室廣泛使用的血培養系統，但2個血培養系統對常見病原菌的陽性檢出率和報陽時間存在一定的差異[3]。

在實際工作中，由于工作流程和資源投入等多種因素的制約，血培養樣本采集后不能及時放入培養儀的情況較為普遍，分析延遲放瓶對血培養陽性檢測結果的影響十分重要。孫景勇等[4]發現，延遲放瓶＜16 h，BACT/ALERT 3D血培養系統和BACTEC 9120血培養系統的陽性檢出率差異均無統計學意義（P＞0.05）；而延遲放瓶24 h，前者的陽性檢出率明顯高于后者（P＜0.05）。本研究中，所有樣本經室溫放置不同時間后，在2種血培養系統中均可檢測到陽性結果。產生差異的原因可能與測試菌種不同有關，孫景勇等[4]測試的是大腸埃希菌，其在放置過程中可能會因為產酸量積累的原因，干擾血培養儀的監測過程和結果判斷。此外，本研究使用的BACTEC FX血培養系統與BACTEC 9120血培養系統在檢測原理上的差別也可能是陽性檢出率出現差異的原因。

肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌作為臨床常見苛養菌，是我國兒童臨床分離優勢株，分離率明顯高于成人[5]，在昆明醫科大學附屬兒童醫院BSI病原中所占比例呈逐年上升趨勢[6]。本研究中，2種苛養菌在BACTEC FX血培養系統中的報陽時間均短于BACT/ALERT 3D血培養系統（P＜0.001），與相關報道結果[7-8]一致。肺炎鏈球菌經室溫延遲放置8、16和24 h后，報陽時間均顯著長于0 h放置樣本。有研究結果表明，肺炎鏈球菌可在血培養陽性報警后8～10 h內自溶死亡[9]，延遲培養樣本報陽時間延長可能也與此相關，因此臨床懷疑肺炎鏈球菌BSI時，應立即送檢。而流感嗜血桿菌經室溫延遲放置0和8 h，報陽時間差異無統計學意義（P＞0.05），室溫放置8 h不影響其在2種血培養系統中的報陽時間，提示延遲放瓶對不同菌種的陽性檢出影響不同。

本研究還發現，菌液濃度、延遲放瓶、血培養系統3個因素之間有相互作用，共同影響血培養檢測結果。肺炎鏈球菌延遲放瓶時，報陽時間受另外2個因素的共同影響 ，BACTEC FX血培養系統檢測低濃度肺炎鏈球菌樣本時，報陽時間受延遲放瓶影響，而高濃度樣本的報陽時間受延遲放瓶的影響不明顯。流感嗜血桿菌血培養系統和菌液濃度會相互影響，在低濃度條件下，BACTEC FX血培養系統報陽時間短于BACT/ALERT 3D血培養系統，而高濃度條件下，差異不明顯。

綜上所述，隨著延遲放瓶時間的延長，2種苛養菌報陽時間均呈延長趨勢，BACTEC FX血培養系統在報陽時間上相較于BACT/ALERT 3D血培養系統具有一定優勢。這一趨勢受多因素作用，不同菌種、菌液濃度及血培養系統均會影響延遲送檢時細菌的陽性檢出情況。本研究僅對兒童瓶及2種常見苛養菌進行了初步評估，具有一定的局限性。各臨床微生物室應根據自身實際情況，有針對性地進行血培養影響因素的評估和控制，建議評估并逐步完善對陰性培養瓶的盲轉培養，以最大限度避免因受延遲放瓶影響而造成的漏檢。