響應面法優化甜椒中維生素C的提取工藝

納紅菱 黃 榮

（成都師范學院化學與生命科學學院/功能分子結構優化與應用四川省高校重點實驗室，四川成都 611130）

維生素 C（vitamin C，VC）又名 L-抗壞血酸（ascorbic acid），是一種己糖醛酸[1]，能夠調節體內的氧化還原代謝并保持正常生理功能[2]，具有防治缺鐵性貧血、心血管疾病，預防白內障，抗癌[3]等功效。維生素C根據來源分為天然和合成兩大類，其中天然維生素C除保持合成維生素C的基本功效外，還含有黃酮、維生素P、類黃酮等多種活性成分，具有較高的抗氧化、提高免疫力、抗慢性疾病等功效[4]，其生物利用度比合成維生素C高35%。天然維生素C主要來源于水果蔬菜。

甜椒含有大量的多酚、黃酮類胡蘿卜素以及維生素類的抗氧化成分，可以預防癌癥、動脈粥樣硬化和其他與氧化應激有關的疾病。甜椒中維生素C含量較高，被譽為“蔬菜之冠”[5]。目前對于果蔬中維生素C的研究并不多，缺乏果蔬中提取維生素C的方法，未見從甜椒中提取維生素C的方法。

維生素C的測量方法主要有化學發光法[6]、熒光法[7-8]、高效液相色譜法[9]、2，4－二硝基苯肼法[10]、碘量法[11]、紫外分光光度法[12]等，其中熒光法具有較高的靈敏度、穩定性，且操作簡單。本研究采用單因素結合響應曲面法優化甜椒中維生素C的提取工藝，采用熒光法測量其含量，為天然維生素C的開發和應用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料。甜椒于60℃烘干，粉碎過60目篩。

1.1.2 試劑。維生素C標準品，由中國食品藥品檢定研究院生產；偏磷酸、冰醋酸、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、草酸、硼酸、鄰苯二胺、活性炭，均為分析純。

1.1.3 儀器與設備。主要包括熒光分光光度計（F-380型，天津港東科技股份有限公司）、數字酸度計（PHS-3CW型，上海般特儀器有限公司）、數顯恒溫水浴鍋（W5-100SP型，上海申生科技有限公司）、分析天平（FA2201N型，上海菁華科技儀器有限公司）、電熱恒溫干燥箱（202-1A型，北京中興偉業儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取劑選擇。精密稱取4份5 g甜椒粉，依次加入20mL 0.03 g/mL偏磷酸-乙酸溶液（15 g偏磷酸+40mL冰乙酸）、10%鹽酸溶液、2%草酸溶液、10%鹽酸+2%草酸（體積比為2∶8），調節 pH值為2，在25℃下水浴加熱30min，分別測量提取量。

1.2.2 偏磷酸-乙酸提取甜椒中維生素C的單因素試驗。分別考察偏磷酸-乙酸溶液濃度、pH值、提取溫度、提取時間等4個因素對甜椒中維生素C提取量的影響。

精密稱取5份5 g甜椒粉，依次加入20mL濃度為 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/mL 的偏磷酸-乙酸溶液，調節pH值為2，在25℃下水浴加熱30min，分別測量提取量。

精密稱取5份5 g甜椒粉，加入20 mL濃度為0.02 g/mL的偏磷酸-乙酸溶液，調節pH值為1、2、3、4、5，在25℃下水浴加熱30min，分別測量提取量。

精密稱取5份5g甜椒粉，加入20 mL濃度為0.02 g/mL的偏磷酸-乙酸溶液，調節pH值為2，分別在溫度 20、25、30、35、40 ℃下水浴加熱 30min，分別測量提取量。

精密稱取5份5 g甜椒粉，加入20mL濃度為0.02 g/mL的偏磷酸-乙酸溶液，調節pH值為2，分別在 25 ℃下水浴加熱 10、20、30、40、50min，分別測量提取量。

1.2.3 響應面法優化試驗。在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken設計原理，以偏磷酸-乙酸溶液濃度（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）為自變量，設計了三因素三水平響應面試驗。試驗因素與水平見表1。

表1 響應面法優化甜椒中維生素C提取工藝試驗因素與水平

1.2.3 維生素C提取量測定。維生素C本身不具有熒光，但在活性炭的作用下可將還原型維生素C氧化為氧化型維生素C，氧化型維生素C再和鄰苯二胺反應可生成一種熒光化合物。若試樣中存在丙酮酸，丙酮酸和鄰苯二胺反應也可產生熒光物質，干擾維生素C的測定，因而在試驗中可加入硼酸和維生素C反應形成絡合物測出空白值，以減少干擾。

標準儲備液制備：精密稱取0.05 g維生素C，用偏磷酸-乙酸溶液溶解并稀釋到50mL。吸出10mL置于100mL容量瓶中，用偏磷酸-乙酸溶液稀釋到100mL。再吸出50mL于100mL帶塞錐形瓶中，向錐形瓶中加入2 g活性炭，搖振2min，抽濾，濾液為標準氧化液。分別吸取20mL于2個50mL容量瓶中，作為標準液和標準空白液。向標準空白液中加入5mL偏硼酸-乙酸鈉溶液，用水定容至50mL，放置于4℃冰箱，待測；向標準液中加入5mL 500 g/L乙酸鈉溶液，用水定容至50mL。

標準工作曲線繪制：準確分別吸取標準液0.5、1.0、1.5、2.0mL置于10mL帶塞刻度試管中，用水定容至2.0mL。另外準確吸取2.0mL標準空白液于10mL試管中。在暗室里迅速向各試管中加入5mL鄰苯二胺溶液，在25℃下反應20min，在激發波長338 nm、發射波長420 nm處測其相對熒光強度值ΔF。得到回歸方程為：y=62.443x-144.51（R2=0.999 3）。維生素C標準品濃度與熒光強度在2.8～11.5μg/mL范圍內有較好的線性關系。

樣品測定：量取一定體積的待測液，按上述方法測定樣品液的相對熒光強度值ΔF。根據樣品液熒光強度和標準曲線、回歸方程計算待測液中維生素C提取量。

2 結果與分析

2.1 提取劑確定

提取劑為0.03 g/mL偏磷酸-乙酸溶液（15 g偏磷酸+40mL冰乙酸）、10%鹽酸溶液、2%草酸溶液、10%鹽酸+2%草酸（體積比2∶8），甜椒中維生素C提取量分別為 96.263、95.061、93.701、92.325mg/100 g。可以看出，以偏磷酸-乙酸溶液作為提取劑，維生素C提取量最高，故選擇偏磷酸-乙酸溶液作為提取劑。

2.2 單因素試驗

2.2.1 偏磷酸-乙酸溶液濃度對甜椒中維生素C提取的影響。偏磷酸-乙酸溶液濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/mL時，甜椒中維生素C提取量分別為93.263、95.325、94.061、91.701、90.745mg/100g。 可以看出，甜椒中維生素C提取量隨著偏磷酸-乙酸溶液濃度的增大呈先增大后減小趨勢，濃度為0.02 g/mL時提取效果最佳。

2.2.2 pH值對甜椒中維生素C提取量的影響。pH值為 1、2、3、4、5 時，甜椒中維生素 C 提取量分別為86.825、96.488、94.347、93.316、87.032mg/100 g。可以看出，甜椒中維生素C提取量隨著pH值的增大呈現先增大后減小趨勢，pH值為2時提取效果最佳。

2.2.3 提取溫度對甜椒中維生素C提取量的影響。當提取溫度為 20、25、30、35、40 ℃時，甜椒中維生素C 的 提 取 量 分 別 為 94.552、96.987、93.056、92.925、92.656mg/100 g。可以看出，甜椒中維生素C的提取量隨著溫度的增大呈現先增大后減小趨勢，提取溫度為25℃時提取效果最佳。

2.2.4 提取時間對甜椒中維生素C提取的影響。水浴加熱時間為 10、20、30、40、50min 時，甜椒中維生素 C 提取量分別為 89.813、95.704、96.166、92.945、90.522mg/100 g。可以看出，甜椒中維生素C的提取量隨著水浴加熱時間的增大呈現先增大后減小的趨勢，提取時間為30min時提取效果最佳。

2.3 響應面法優化試驗

利用軟件Design Expert10.0.7.b對表2試驗數據進行回歸分析，得二次多項式回歸方程：維生素C提取量=95.09-1.01A+0.17B-0.12C+3.50AB-0.86AC+2.80BC-0.44A2-0.21B2-0.22C2。對回歸模型進行顯著性檢驗，結果見表3。

表2 響應面法優化甜椒中維生素C提取工藝試驗結果

表3 響應面法優化甜椒中維生素C提取工藝的回歸模型方差分析結果

由表3可知，該回歸模型P=0.004 1＜0.05，說明回歸模型差異顯著；失擬項P=0.000 6＜0.05，說明失擬項也差異顯著。其方程復相關系數R2為0.921 4，則表明模擬和實際值的擬合度較高，具有可信度；R2Adj為0.820 3，說明能夠較好地反映真實測定值。AB、BC的P值均小于0.05，說明其對甜椒中維生素C的提取含量影響顯著。 AC、A2、B2、C2的 P 值大于 0.05，說明其對甜椒中維生素C的提取含量沒有顯著影響。由表3中F值可知，各因素對甜椒中維生素C提取含量的影響程度依次為A＞C＞B。

響應面能直接反應各因子對響應值影響的大小，從等高線圖中能看出最佳提取條件下各因子取值范圍。響應面坡度反映了各因素對響應值維生素C提取量的影響。如果坡度較為平緩，則說明處理條件變化不影響響應值大小；反之，則響應值對處理條件的改變非常明顯。從圖1～3可以看出，偏磷酸-乙酸溶液濃度和提取溫度的交互作用對維生素C提取量的影響最大，偏磷酸-乙酸溶液濃度和提取時間的交互作用對維生素C提取量的影響最小。

反應條件優化及模型驗證結果：用響應面法進一步優化甜椒中維生素C的提取條件，結果表明從甜椒中提取維生素C的最優條件為偏磷酸-乙酸溶液濃度0.02 g/mL、提取溫度25℃、提取時間30min，在此條件下甜椒中維生素C的提取量預測值為95.20mg/100 g。

3 結論

本文以甜椒為原料，采用單因素試驗和響應面分析法優化提取甜椒中維生素C的工藝條件，得出甜椒中維生素C的最佳提取條件為：提取液為偏磷酸-乙酸、提取液濃度為0.02 g/mL、pH值為2、提取溫度為25℃、提取時間為30min，在此條件下維生素C提取量為97.34mg/100 g。該方法工藝簡單、經濟、提取率較高，可為甜椒等果蔬中維生素C的開發利用提供參考。