酶輔助超聲法提取陜產黃精總黃酮及其抗氧化、抗A549細胞增殖活性研究

郭凱麗，劉繼平，趙重博，史永恒，王 斌，權利娜，過曉芳，朱星枚*

1陜西中醫藥大學藥學院；2陜西省中醫藥管理局中藥藥效機制與物質基礎重點研究室；3陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，咸陽 712046；4西安工業大學數理系，西安 710032

黃精(Polygonatumsibiricum，PS)是我國著名藥食同源藥材，主產于河北、陜西、安徽、云南、浙江、黑龍江等地區，藥用取其干燥根莖，用于養陰補氣，補腎潤肺[1]。研究表明黃精通過多糖、黃酮、皂苷、木脂素、氨基酸、揮發油等成分，發揮抗腫瘤、抗衰老、調節免疫等藥理作用[2,3]，臨床廣泛用于治療食管癌、胃癌、直腸癌、肺癌等惡性腫瘤[4]。

我們前期基于網絡藥理學研究發現黃精中黃酮類成分可以通過細胞凋亡、低氧誘導因子-1、腫瘤壞死因子等信號通路發揮抗非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)作用，其具體物質基礎與分子機制需通過提取黃精總黃酮進行研究。研究表明陜產黃精總黃酮含量最高，滇黃精總黃酮含量最低[5]。黃精總黃酮提取方法包括浸提法[6]、超聲法[7]、酶法輔助超聲法[8]，但未見對提取工藝的優化及黃酮成分分析，各成分含量及其抗氧化、抗腫瘤作用研究更少。

近年來超聲波聯合酶法逐漸應用到中藥有效成分提取[9-11]。超聲波可以在液體介質中傳播產生特殊的“空化效應”，以強大的沖擊波作用中藥材，加速植物有效成分的浸出。纖維素酶主要通過降解植物細胞壁，增加細胞壁的滲透性，促進中草藥有效成分快速溶出和擴散，從而提高活性化合物的得率[12]。因此，酶輔助超聲法提取中藥有效成分可減少溶劑用量，縮短提取時間，并提高藥用成分的得率[13]。本研究擬采用酶輔助超聲法提取陜產黃精總黃酮，并結合黃酮類物質提取關鍵因素即料液比、乙醇濃度、酶用量、超聲時間等，借助響應面法優化黃酮類物質的最優提取工藝，通過高效液相色譜(High performance liquid chromatography，HPLC)法檢測陜產黃精的黃酮成分，并研究該提取物體外抗氧化、抗A549細胞增殖作用，為開發陜產黃精更豐富的藥效部位提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 藥材、細胞與主要試劑

黃精藥材購自陜西略陽黃精生產基地，經陜西中醫藥大學顏永剛教授鑒定，干燥粉碎后過6號篩備用。人NSCLC細胞系A549購于中國武漢普諾賽生命科技有限公司。蘆丁(批號：T20N11Z131674；純度≥98.5%)、槲皮素二水物(批號：C13A9Y58602；純度≥97%)、黃芩素(批號：C06M11Y112461；純度≥98%)、維生素C(Vc)(批號：S19J6G1；純度≥99.9%)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT)(批號：Y17A9Y307695；純度≥98%)、檸檬酸(批號：20190711；純度≥99.5%)檸檬酸鈉(批號：20190708；純度≥99.0%)、纖維素酶(批號：191125；純度50 U/mg)、1,1-二苯基-2-苦肼基試劑盒(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)(批號：20210417；純度≥98%)、羥基自由基(批號：20210608；純度≥98%)、總還原能力檢測試劑盒(ABTS)(批號：031221210518；純度≥98.5%)、CCK-8(批號：EG20201111)。其中，蘆丁、槲皮素二水物、黃芩素、維生素C、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(上海源葉生物公司)；檸檬酸、檸檬酸鈉(天津科密歐化學公司)；纖維素酶(上海藍季生物公司)；1,1-二苯基-2-苦肼基試劑盒(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、羥基自由基、總還原能力檢測試劑盒(ABTS)(南京建成生物公司)、CCK-8(南京恩晶生物公司)。

1.2 儀器

800Y中藥粉碎機(永康市猛牛商貿有限公司)；Scout SE分析天平(奧豪斯儀器有限公司)；Sartorius pH酸度計(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；KS-500DV液晶超聲波清洗器(昆山潔力美超聲儀器有限公司)；TDZ5-WS低速離心機(湖南湘儀實驗儀器開發有限公司)；TY2021000834全波長酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；Ultimate 3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 黃精總黃酮的含量測定

精密稱取蘆丁標準品10.0 mg，甲醇(色譜純)溶解定容，配成濃度為0.2 mg/mL的對照品儲備液，4 ℃保存備用。精密吸取蘆丁對照品儲備液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置25 mL容量瓶，按亞硝酸鈉-硝酸鋁法[14]法以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得標準曲線y=10.239x+0.027 2(R2=0.997 6)。

精密稱取黃精粉末2.00 g，90%乙醇溶解。稱取0.04 g纖維素酶，溶于400 μL 0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.8)，40 ℃水浴活化30 min。50 ℃，超聲20 min后沸水滅活10 min，趁熱過濾，90%乙醇補足至32 mL。精密吸取上述溶液1.0 mL，依文獻測定黃精總黃酮提取液的吸光度，計算總黃酮濃度及得率[14]。

總黃酮得率=(C×V)/m× 100%

式中，C：總黃酮濃度(g/mL)；V：藥液體積(mL)；m：藥材質量(g)。

1.3.2 響應面法優化提取黃精總黃酮的最佳工藝

分別進行纖維素酶用量A(1%、1.5%、2%、2.5%、3%)，乙醇濃度B(40%、50%、60%、70%、80%、90%)，超聲時間C(5、10、15、20、25、30、40、50、60、70 min)，料液比D(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)單因素試驗，依據以上試驗結果，設計四因素三水平的響應面試驗，Box-Behnken法篩選最佳提取工藝。

1.3.3 HPLC法測定黃精黃酮提取物中黃酮成分及含量

1.3.3.1 對照品溶液的制備

對照品貯備液：分別取蘆丁、槲皮素二水物和黃芩素對照品適量，精密稱定，置于不同10 mL量瓶中，加100%甲醇溶解并定容至刻度，得對照品貯備液。混合對照品溶液：分別移取適量上述3種對照品貯備液，置于同一5 mL量瓶中，用100%甲醇制備成含有0.5 mg/mL槲皮素二水物、0.5 mg/mL黃芩素、0.5 mg/mL蘆丁的混合標準對照品溶液。4 ℃冰箱保存，備用。

1.3.3.2 供試品溶液的制備

將“1.3.1”項制得提取液濃縮至無醇味。濃縮液經等倍量乙醚萃取3次，合并濃縮后用甲醇溶解，0.45 μm濾器過濾，備用。

1.3.3.3 色譜條件與系統適用性試驗

安捷倫ZORBAX SB-pheny1(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)為流動相，梯度洗脫50 min(0～45 min，15%→55%A；45～50 min，55%→15%A)，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長280 nm，進樣量20 μL。取“1.3.3.1”項下混合對照品溶液和“1.3.3.2”項下供試品溶液，按此色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖。

1.3.3.4 標準曲線及線性范圍

取“1.3.3.1”項下對照品溶液，分別進樣4、8、12、16、20 μL，于280 nm波長處測其峰面積。進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線并計算回歸方程，得黃芩素標準曲線y= 23.658x+ 216.64(R2= 0.999 2)；槲皮素二水物標準曲線y= 5.194x+ 55.611(R2= 0.999 7)。

1.3.3.5 含量測定

取“1.3.3.2”項下供試品溶液分別重復進樣3次，測定供試品溶液的峰面積并根據“1.3.3.4”項下線性關系求得樣品中各成分的含量。

X=(C×V)/m

式中，X：每g供試品中化合物的含量(μg/g)；C：標準曲線求得供試品溶液中目標化合物的質量濃度(μg/mL)；V：供試品溶液的體積(mL)；m：藥品樣品質量(g)。

1.3.4抗氧化活性評價

以下各項實驗以蒸餾水作空白組，維生素C、BHT分別作陽性對照組。

1.3.4.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力的測定

配制不同質量濃度(0、12.5、25、50、100 μg/mL)黃精總黃酮溶液，取上述溶液100 μL，加0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液100 μL，混勻，室溫避光30 min，517 nm測定A值。每組實驗重復3次。

DPPH自由基清除率=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100%

式中，A樣品組：加入樣品的DPPH無水乙醇溶液的吸光度；A對照組：加入樣品的80%甲醇溶液的吸光度；A空白組：加入80%甲醇的DPPH無水乙醇溶液的吸光度。

1.3.4.2 羥基自由基清除能力的測定

配制不同質量濃度(0、12.5、25、50、100 μg/mL)黃精總黃酮溶液，精密吸取上述溶液50 μL，依次加入50 μL 6 mmol/L FeSO4、100 μL 6 mmol/L H2O2，充分搖勻后室溫放置10 min；再加入50 μL 6 mmol/L水楊酸，充分搖勻室溫放置30 min，510 nm測定A值。每組實驗重復3次。

羥自由基清除率=(A0-Ai)/A0×100%

式中，A0：50 μL蒸餾水代替樣品的吸光度；Ai：加入樣品的吸光度。

1.3.4.3 總抗氧化能力的測定(ABTS快速法)

將7.5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和132 μL 140 mmol/L過硫酸鉀水溶液避光反應16 h，用乙醇稀釋到A732 nm約0.7備用。配制不同質量濃度(0、12.5、25、50、100 μg/mL)黃精總黃酮溶液，精密吸取上述溶液50 μL，加入100 μL ABTS，避光10 min，734 nm測吸光值(Ai)。每組實驗重復3次。

總抗氧化化能力=[1-(Ai-Ai0)/A0]×100%

式中，Ai：加入樣品的ABTS溶液的吸光度；A0：加入無水乙醇的ABTS溶液的吸光度；Ai0：加入蒸餾水的樣品提取液的吸光度。

1.3.5 黃精總黃酮體外抗A549增殖作用

分別給予A549細胞不同濃度的黃精黃酮提取物分別處理24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃，5% CO2恒溫培養3.5 h，600 nm測定吸光值(OD)，每組藥設置五個復孔，IC50重復測定5次。

細胞生存率 =[(OD實驗-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100%

式中，OD實驗：加入培養基、細胞、CCK-8和藥的吸光度；OD對照：加入培養基、細胞和CCK-8的吸光度；OD空白：加入培養基和CCK-8的吸光度。

1.3.6 統計分析

采用GraphPad Prism 7.0進行數據分析，One-way Analysis of Variance(ANOVA)比較多組間差異，t檢驗比較兩組間差異，P<0.05為具有統計學差異。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

纖維素酶用量為2.5%時，總黃酮得率最高(見圖1a)。總黃酮得率在纖維素酶用量1%～3%范圍內先升后降，可能植物細胞破壁率隨纖維素酶用量增加而提高，但纖維素酶用量超過2.5%時，植物細胞內雜質溶出增加，反而降低黃酮得率[15]。

圖1 各單因素對黃精總黃酮得率的影響

乙醇濃度為80%時，總黃酮得率最高(見圖1b)。總黃酮得率在乙醇濃度40%～90%范圍內先升后降，可能黃酮類是醇溶性成分，一定范圍內，黃酮類溶出率隨乙醇濃度提高而增加。當乙醇濃度超過80%時，纖維素酶活性被抑制，整體黃酮得率反而下降[16]。

超聲時間15 min時，總黃酮得率最高(見圖1c)。總黃酮得率在超聲時間5～70 min范圍內先升后降，可能延長超聲時間破壞了纖維素酶活性，導致得率降低[17]。

料液比1∶15(g/mL)時，總黃酮得率達峰值(見圖1d)。總黃酮得率在料液比1∶5～1∶30(g/mL)范圍內先升后降，可能隨著料液比增加，溶出物雜質增多，總黃酮得率相對降低[18]。

2.2 響應面法優化黃精總黃酮提取工藝結果

2.2.1 響應面法優化試驗設計及結果

依據“2.1”各單因素結果(見圖1)，四因素三水平結果見表1。應用Box-Behnken法進行響應面設計(見表2)。黃精總黃酮得率Y的二次多項回歸模型∶Y=9.06+1.54A+0.65B+0.51C-0.59D-0.46AB+0.43AC+0.42AD+1.59BC-0.49BD-2.42CD-1.96A2+0.36B2-0.73C2-0.12D2。

表1 試驗因素及水平

表2 響應面試驗設計及結果

2.2.2 響應面回歸模型方差分析

Design Expert 10.6.4軟件分析上述二次多元回歸模型方差(見表3)。回歸模擬方程中，一次項纖維素酶(A)，二次項纖維素酶(A2)及超聲時間(C)與料液比(D)互作對總黃酮得率影響顯著。各因素對黃精總黃酮得率影響的主次順序為：纖維素酶用量>乙醇濃度>料液比>超聲時間。

表3 回歸模型方差分析

2.2.3 各因素互作關系可視化

Design-Expert 10.6.4軟件繪制各影響因素對黃精總黃酮得率影響的響應面曲線圖。曲線越陡峭，該因素變化對結果的影響越大；曲線越平直，該因素變化對結果的影響越小。各因素存在交互作用，其中超聲時間與料液比，乙醇濃度與超聲時間的互作作用對黃精總黃酮得率影響最顯著(見圖2)。

圖2 各因素對黃精黃酮得率的影響

2.2.4 最優提取工藝條件與黃精總黃酮的得率

黃精總黃酮最佳提取工藝：纖維素酶用量2%，乙醇濃度90%，超聲時間20 min，料液比1∶16(g/mL)。根據以上最優工藝，平行3次提取黃精總黃酮，黃精總黃酮的得率為103.10 ± 0.02 μg/g。該法操作簡便，結果可靠。

2.2.5 2種黃酮化合物的分離色譜圖與含量

在“1.3.3.3”色譜條件下，2種黃酮化合物與相鄰峰間的分離度均大于1.5，色譜圖見圖3。取制備好的供試品溶液進樣，根據色譜峰面積平均值和標準曲線計算各物質的含量。結果得出，陜產黃精黃酮提取物中主要有槲皮素二水物和黃芩素兩種黃酮類，得率分別為6.43 ± 0.25 μg/g和92.31 ± 1.75 μg/g。與文獻報道[19]的黃精飲片中黃酮成分及含量有差異。陜產黃精黃酮提取物中未檢測出蘆丁及甘草素，檢測出槲皮素二水物，同時首次檢測出黃芩素成分，且含量較槲皮素高。

圖3 高效液相色譜圖

2.2.6 黃精總黃酮抗氧化能力

黃精總黃酮對DPPH、羥自由基清除能力及總抗氧化能力如圖4，DPPH自由基是一種穩定的自由基，滇黃精多糖當質量濃度大于1 g/mL時，表現出對DPPH的清除能力[19]，圖4a表明黃精總黃酮具有較強的清除DPPH能力，其清除DPPP自由基的EC50是11.20 μg/mL，較維生素C(EC50=1.09 μg/mL)和BHT弱(EC50=4.05 μg/mL)；但隨著黃精黃酮濃度增加，其對DPPH自由基的清除能力趨近維生素C的清除能力，且較BHT強。圖4b表明黃精總黃酮清除羥自由基的EC50是57.88 μg/mL，與BHT(EC50=51.14 μg/mL)清除能力相當，但弱于維生素C(EC50=26.49 μg/mL)；圖4c表明黃精總黃酮總抗氧化能力的EC50是23.75 μg/mL，其還原力介于維生素C(EC50=13.42 μg/mL)與BHT之間。

圖4 黃精總黃酮對抗氧化能力的影響

2.2.7 黃精總黃酮的體外抗A549增殖能力

不同濃度的黃酮提取物(0、4.78、9.56、19.1、38.2、76.5、153 μg/mL)處理A549細胞，其24、48、72 h的IC50分別是25.18、12.52、9.25 μg/mL。表明黃精黃酮提取物對A549細胞有較強的抗增殖能力，且具有劑量和時間依賴性(見圖5)。

圖5 不同劑量黃精總黃酮作用A549細胞24、48、72 h的生長曲線

3 結論

本文采用超聲輔助纖維素酶法提取陜產黃精總黃酮，借助響應面法優化黃精總黃酮的提取工藝為：纖維素酶用量2%，乙醇濃度90%，超聲時間20 min，料液比1∶16(g/mL)，該條件下陜產黃精總黃酮得率為103.10 ± 0.02 μg/g。據文獻[5]，該得率比黑龍江阿城產黃精總黃酮得率低，較安徽九華山產多花黃精及廣西百色和云南臨滄產滇黃精總黃酮得率高。多因素分析中對得率影響最大的是纖維素酶用量，說明黃精的破壁率與其黃酮物質的溶出成正比，此結果與文獻報道一致[8]。各因素互作關系研究表明超聲時間與料液比，乙醇濃度與超聲時間互作對黃精總黃酮得率影響最顯著。本研究首次應用HPLC方法分析并測定了陜產黃精中的黃酮成分及含量。不同于貴州國藥集團同濟堂的黃精飲片及亳州北京同仁堂的黃精飲片[20,21]，陜產黃精黃酮中以槲皮素二水物和黃芩素為主，此兩種成分均具有很好的抗腫瘤、抗氧化作用[22,23]，其中首次發現陜產黃精黃酮中富含黃芩素成分。

抗氧化實驗結果表明陜產黃精總黃酮具有較強的抗氧化能力，其對DPPH自由基的清除率與維生素C相當，小劑量使用時，其抗氧化能力不及維生素C和BHT，但隨劑量增加，其清除自由基能力逐漸增強，基本和維生素C和BHT相當。本文還首次證實陜西產黃精黃酮提取物體外可呈劑量和時間依賴性抗A549細胞增殖。這與我們前期網絡藥理學和循證醫學研究[24]結果一致，該研究可為進一步研究陜產黃精黃酮類成分及黃精抗NSCLC作用提供物質基礎。