基于UPLC-QTOF-MS分析不同產地鐵皮石斛化學成分含量差異

陳定康，李芝蘭，楊 柳，胡江苗

1中國科學院昆明植物研究所；2中國科學院昆明植物研究所植物醫生研發中心，昆明 650201；3中國科學院大學，北京 100049

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)是蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生附生型草本植物，自古以來都是我國應用中藥材中的名品，其自然主要分布區在安徽、浙江、湖南、福建、廣西、四川、云南等地[1]。鐵皮石斛的人工種植主產區為云南、浙江、安徽、廣東。鐵皮石斛中含有多種化學物質，包括多糖、生物堿類、黃酮類、聯芐類、木脂素類及揮發性化學成分等活性成分，具有極高的藥用價值[2]。傳統中醫認為鐵皮石斛具有益胃生津，滋陰清熱的功效，用于治療熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔等癥狀[3]。現代藥理學研究表明，鐵皮石斛中的黃酮類成分具有降血糖功效[4]，聯芐類和多糖類成分可以抗炎[5]，聯芐、黃酮及酚性成分具有抗氧化活性[6]，聯芐類成分具有抗癌作用[7]，多糖可以調節機體免疫力[8]等。

鐵皮石斛作為藥用植物，其產量和品質受原植物種類、生長面積、種植技術、土壤養分、氣候條件、采收期等因素的影響[9]。鐵皮石斛野生產量稀少，目前市場上流通的商品鐵皮石斛主要來源于全國各地的人工種植基地[10]。由于種植基地分布范圍較為廣泛，各地出產的鐵皮石斛生長過程中的各種條件無法保證一致，勢必造成鐵皮石斛藥用價值的差異。根據2020版《中國藥典》對鐵皮石斛品質的評價方法，以多糖及醇溶性浸出物的含量為評價品質好壞的標準[11]。藥典中規定的多糖及醇溶性浸出物都為粗提物，且檢測方法比較簡略，容易產生較大誤差。這說明只以多糖及醇溶性浸出物含量作為鐵皮石斛品質的評價指標是具有一定局限性的，所以選擇一種鐵皮石斛中含量較高并具有良好的藥理活性的化學成分進行質量標定是勢在必行的[12]。本實驗擬對不同產地鐵皮石斛中除多糖外的其他化學成分進行全面分析，找出評價鐵皮石斛質量的標志組分，完善鐵皮石斛的質量評價標準。

1 材料

1.1 材料與試劑

本研究所用植物材料是鐵皮石斛的莖部位，采集于云南、安徽、浙江和廣東等23個不同產地，產地具體信息見表1，為了方便討論，每個產地都有一個特定的編號TPX(X=1～23)。所有植物材料都經過吳之坤博士(貴陽中醫藥大學，貴州貴陽)鑒定。石斛酚(純度≥99.15%)和柚皮素(純度≥99.64%)兩種標準品由本實驗室自行提取。

表1 不同產地鐵皮石斛樣本來源的地理信息

1.2 儀器與設備

Waters Xevo TQ-S超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜聯用儀(美國 Waters公司)；Agilent 1290 UPLC/6540 Q-TOF超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜(美國Agilent Technologies公司)；BT125D型分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 醇提物的制備

2.1.1 提取工藝

鐵皮石斛的莖放置在烘干機中，烘干溫度設置為80 ℃，完全干燥后打成粉末。稱取一定量的粉末，按1∶10(粉末∶80%乙醇，m/V)比例加入溶劑，80 ℃水浴加熱回流提取2次，每次2 h。收集提取液，去除溶劑后即得不同產地的鐵皮石斛醇提物。

2.1.2 醇提物得率

醇提物收集后稱重，用以下公式計算得率：

式中，m醇提物表示醇提物質量，m鐵皮石斛粉末表示稱得鐵皮石斛粉末質量。

本次實驗中，不同產地鐵皮石斛醇提物得率結果如表2所示。醇提物得率范圍為6.80%～17.84%。

表2 不同產地鐵皮石斛醇提物得率和定量分析結果

2.2 定性分析

由于受品種品系、種植環境、栽培管理以及采收時間等條件影響，鐵皮石斛內含物構成以及含量差異明顯。故此，我們利用UPLC-QTOF-MS對不用產地的鐵皮石斛醇提物進行了化學成分分析。

2.2.1 分析條件

使用超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜(Agilent 1290 UPLC/6540 Q-TOF)分析醇提物的化學組成。液相色譜流動相100%水溶液(A)-100%乙腈溶液(B)，梯度洗脫，洗脫順序為：0～30 min，20%→100% B；30～31 min，100%→20% B；31～35 min，20% B。檢測波長：280 nm，流速：1 mL/min，柱溫：30 ℃，色譜柱型號為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)。質量檢測器設定為ESI負離子模式。干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量8 L/min；霧化器壓力：30 psig；毛細管電壓：3 500 V；碰撞電壓：-175 V；錐孔體：-65 V；相對分子質量掃描范圍：m/z50～1 700。

2.2.2 鐵皮石斛中化合物的鑒定

根據第“2.2.1”節的方法，分析了23個鐵皮石斛醇提物樣本。為確定最佳檢測波長，本試驗同時考察了230、254、280 nm的色譜峰分離情況，結果顯示230 nm的譜圖中化合物分離度較好、吸收較強，故選擇230 nm作最終檢測波長。23個鐵皮石斛醇提物樣品色譜圖如圖1所示。

圖1 23個鐵皮石斛醇提物樣品的指紋圖譜

將質譜數據導入Agilent Mass Hunter Workstation軟件，對出峰初步處理。依據峰面積、保留時間和分子量，排除假陽性的碎片峰。采用Qualitative Analysis B.06.00軟件擬合計算得到相應的分子式，結合質譜數據，與本地數據庫進行匹配，初步推測化學成分，如圖2所示。

圖2 阿魏酰酪胺(A)和柚皮素(B)的質譜

對各產地鐵皮石斛主要成分進行了表征，結果如表3所示。從不同產地鐵皮石斛醇提物中共鑒定了(-)-lirioresinol B(1)、fructose-phenylalanine(2)、香草酸(3)、對羥基苯甲酸(4)、石斛堿(5)、對香豆酸(6)、3-羥基肉桂酸(7)、vicenin 2(8)、vicenin 1(9)、apiin(10)、4′-O-glucosylvitexin(11)、acanthoside B(12)、蘆丁(13)、6-C-α-L-arabinopyranosyl-8-C-β-D-xylopyranosylapigenin(14)、vicenin 3(15)、moupinamide(16)、2′-O-Rhamnosylvitexin(17)、柚皮素(18)、dendronobiloside A(19)、石斛酚(20)、Pinellic acid(21)、N-isopentenyldendrobine(22)、dihydroconiferyl dihydro-p-coumarate(23)、densiflorol A(24)、2-methyl-1H-indol-7-ylβ-D-mannopyranoside(25)、2-hydroxydendrobine(26)、vanilloside(27)、aduncin(28)、acuminoside(29)、棕櫚酸(30)、N-反式-對香豆酰酪胺(31)、eicosyl caffeate(32)等32種可能存在的化合物。對這32種成分進行進一步分析顯示，(-)-lirioresinol B(1)、fructose-phenylalanine(2)、石斛堿(5)、對香豆酸(6)、vicenin1(9)、蘆丁(13)、moupinamide(16)、柚皮素(18)、石斛酚(20)、densiflorol A(24)、vanilloside(27)、aduncin(28)、棕櫚酸(30)等13種化合物是不同產地鐵皮石斛的共有成分。

表3 不同產地鐵皮石斛化學成分鑒定結果

2.3 標準品定量分析

準確稱取標準品，用甲醇溶解成不同濃度用于制作標準曲線。使用超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜聯用儀(Waters Xevo TQ-S)用來分析不同產地醇提物中石斛酚和柚皮素這兩種物質的含量。液相色譜流動相為100%水(A)-100% 乙腈(B)，梯度洗脫，洗脫順序為：0～4 min，20%→35% B；4～7 min，35%→100% B；7～8 min，100%→20% B；8～10 min，20% B。檢測波長：280 nm，流速:0.3 mL/min，色譜柱型號為ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm × 50 mm，1.7 μm)。在質量分析儀中選擇多反應監測(MRM)進行定量分析。石斛酚的離子裂解躍遷為m/z302.85→287.85；柚皮素的離子裂解躍遷為m/z270.81→150.81。石斛酚和柚皮素的錐電壓和碰撞能量分別為30 V和20 eV。優化的通用質譜條件為：脫溶劑溫度350 ℃，脫溶劑氣體600 L/h；毛細管電壓2.5 kV，錐狀氣體流速150 L/h，碰撞氣體流速0.10 mL/min。

2.4 方法學考察

2.4.1 定量標準曲線的繪制

按照目標化合物離子的響應情況，配制不同濃度混標溶液，以標準溶液濃度(x，μg/mL)與對應的峰面積(y)建立標準曲線如圖3所示。由圖得石斛酚的線性回歸方程y=337.766x，在0～180 μg/mL濃度范圍內，各目標化合物線性關系良好，相關系數(r)為0.999 7。柚皮素的線性回歸方程y=213 346x，在0～5 μg/mL濃度范圍內，各目標化合物線性關系良好，相關系數(r)為0.999 5。石斛酚的檢出限和定量限分別為0.18 μg/mL(信噪比=3)和0.70 μg/mL(信噪比=10)；柚皮素的檢出限和定量限分別為0.30 μg/mL(信噪比=3)和1.03 μg/mL(信噪比=10)。

圖3 石斛酚(A)和柚皮素(B)的定量標準曲線

2.4.2 重復性實驗

準確稱取15號產地的樣品10 mg，平行稱量6份，進行定量分析，根據標準曲線方程得出待測物質的含量并計算出相對標準偏差(RSD)。測得待測分析物含量的RSD均小于5%，說明方法的重現性好。

2.4.3 加標回收實驗

根據樣品中石斛酚和柚皮素的含量及線性范圍，確定化合物在樣品中合適的加標量，設置低、中、高三個水平的加標量。加標回收實驗的平均回收率和相對標準偏差數據見表4。實驗結果說明方法的準確度能滿足檢測要求。

表4 加標回收實驗

2.5 石斛酚和柚皮素的含量分析

石斛酚是一種鐵皮石斛中常見的酚類化合物。有研究表明石斛酚可以誘導糖原合成酶激酶3β介導的MYC蛋白降解來達到抑制肺癌細胞增殖的目的[13]。還有資料顯示，石斛酚在抗炎和抗氧化應激等方面具有潛在應用[14]。柚皮素則是石斛中一種常見的黃酮類活性成分，具有抗炎、抗氧化、改善血液質量，保護心血管系統等藥理活性，具有廣闊的開發前景[15]。通過多樣本分析，聯芐和黃酮是鐵皮石斛化學物質構成主成分，這兩類成分具有代表性和普遍性。因此，選取石斛酚和柚皮素作為衡量鐵皮石斛品質的潛在標志化合物，兩個化合物結構如圖4所示。

圖4 石斛酚(20)及柚皮素(18)結構

按所建立的超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)對23種不同產地鐵皮石斛醇提物中的石斛酚和柚皮素含量進行檢測分析，不同產地鐵皮石斛醇提物樣品中所含這兩種化合物含量的結果如表2所示。如結果所示，不同產地鐵皮石斛醇提物中都含有石斛酚和柚皮素這兩個成分，只是在含量上存在差異。通過實驗結果可以得出，通過對這兩個化合物的含量測定來評價鐵皮石斛質量是完全可行的。

3 討論與結論

藥用植物的活性表現受其次生代謝產物構成和含量的影響：一方面取決于藥用植物本身由于品種因素造成的基因表達差異；另一方面，生長過程中降雨、溫度、濕度、日照等農業氣候條件和田間管理等對其品質也有著重要影響。隨著對藥用植物研究的不斷深入，以單一化學成分為指標對中藥材進行質量評價的體系出現了一定的局限性[16]。除了鐵皮石斛多糖之外，鐵皮石斛中還存在有相當可觀的小分子化學成分[17]。廣泛分析這些化學成分，將其與鐵皮石斛的藥材質量關聯起來，進而找出生長環境和種植工藝與鐵皮石斛品質之間的聯系，對鐵皮石斛質量評價標準的后期改進具有重要意義。

本研究利用UPLC-Q-TOF-MS對不同產地的鐵皮石斛醇提物進行天然小分子構成和含量進行了探索，進一步探討鐵皮石斛這一常用中藥的質量評價標準。對鐵皮石斛醇提物進行定性分析，共鑒定了32種主要成分，利用化學分析軟件和本地數據庫對可能的結構和分子式進行推測，得到(-)-lirioresinol B、fructose-phenylalanine、香草酸、對羥基苯甲酸、石斛堿等化學結構。其中，有13種成分在不同產地鐵皮石斛醇提物中均有檢測得到，這表明鐵皮石斛雖然受不同產地的影響所產生次生代謝物雖有一定差異但其主要活性成分認識具有很高的共性。鐵皮石斛中富含酚性物質，主要為石斛酚代表的聯芐類化合物和柚皮素代表的黃酮類成分。相應地，標準品定量分析結果顯示，不同產地的鐵皮石斛中石斛酚和柚皮素的含量存在差異，說明這兩種化合物可以作為潛在的鐵皮石斛質量評價指標。

近年來，本研究組一直關注鐵皮石斛新成分、新功能的開發工作，尤其是鐵皮石斛在化妝品領域的應用。Chen[18]和Qi[19]等對鐵皮石斛多糖的保濕性能進行了研究，結果表明鐵皮石斛多糖提取物具有良好的保濕作用，能提高皮膚細胞對干燥環境的耐受程度。除多糖外，鐵皮石斛中還含有大量酚類化合物，這類天然的抗氧化劑在體外實驗中表現出一定的DPPH、ABTS自由基清除活性[20,21]。目前，鐵皮石斛作為一種高端化妝品原料已廣泛用于美妝護膚產品中，受到廣大消費者的青睞[22]。

為了闡明鐵皮石斛醇提物中可能的活性成分，更好地用于護膚產品開發，我們對不同產地鐵皮石斛醇提物進行了化學物質構成的分析工作，為鐵皮石斛的科學合理利用提供理論基礎。