石豆蘭內生細菌分離鑒定、發酵條件優化及對棉花枯萎病菌的抑制

苗永美，韓 朔，苗翠蘋，張 維，徐榮華

1安徽科技學院生命與健康科學學院，鳳陽 233100；2云南大學生命科學學院，昆明 650504

植物內生菌是指寄生于植物活體組織、器官內的細菌、真菌和放線菌等微生物，幾乎每種植物體內都含豐富菌物，內生菌經過長期進化逐漸與寄主形成共生關系，不會引起明顯的宿主植物外在感染癥狀。研究表明內生菌次級代謝產物不僅能抑制病原微生物，還可以激活宿主植物的免疫應答系統，增強植物防御相關基因的表達譜[1,2]，也是天然藥物重要來源[3]。微生物農藥因綠色環保及對農副品品質影響小等優勢已成為21世紀農藥新產業，代表著植保方向。蘭科植物因其生境內生菌更為豐富，Chen等[4]從5種蘭科藥用植物(白芨、手參、金釵石斛、束花石斛、金線蓮)分離到241株內生菌。作者前期在開展石豆蘭屬植物(Bulbophyllumsp.)離體培養時發現其組織內生菌豐富[5]，有些菌能與寄主離體組織共生。枯萎病是棉花種植期一種常見病害，全國各主要產棉區普遍發生，危害嚴重，估計每年因枯萎病損失皮棉1億公斤?？菸∮杉怄哏牭毒?Fusariumoxysporum)引起，該病原菌根據寄主特異性被劃分為不同?；?，如棉花?；?、黃瓜?；?、香蕉專化型等，有些?；陀指鶕闹髌贩N被進一步劃分為不同生理小種[6]，并形成了與其他國家不同獨特生理小種[7]。不同專化型及生理小種引起的枯萎病需要不同防治方法[8]，因此找準尖孢鐮刀菌不同?；图捌渖硇》N的生防菌尤為重要。本試驗以尖孢鐮刀菌棉花萎蔫?；蜑橹甘揪瑥氖固m屬植物內生菌中尋找具抑制效果的生防菌，優化發酵條件，電鏡觀察主要抑菌物質脂肽對病原菌形態影響。本實驗為抑菌物質的制備進而為棉枯病的生物防治奠定實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

石豆蘭屬植物采自福建屏南鴛鴦獼猴自然保護區；尖孢鐮刀菌棉花枯萎?；?F.oxysporumf.sp.vasinfectum)，由本校農學院段海明博士提供。

1.2 培養基

分離培養基：NA、金氏、YPD、LB、大豆酪蛋白、YG、R2A共7種；指示菌培養用PDA培養基；篩選培養基為LB；發酵培養基以LB為基礎，添加不同C、N。

1.3 方法

1.3.1 內生菌分離

植株表面洗凈、吸干水分，葉片、假鱗莖、橫走莖和根分別剪下，75%酒精處理30 s，無菌水漂洗3次，0.1%HgCl2消毒8 min，無菌水洗5次。材料切碎，按1∶20加無菌水研磨，渦旋混勻，梯度稀釋。取100 μL菌懸液涂布于分離培養基上，30 ℃培養4天。據菌落顏色、大小、形態等特征挑菌落，劃線多次純化。

1.3.2 活性菌篩選

對峙法初步篩出具抑菌活性菌株，瓊脂小柱法復篩。復篩步驟：活性菌活化，30 ℃，180 r/min條件下培養12 h得種子液，2%接種量接入LB(裝量20 mL/50 mL)發酵3 天，離心，上清微孔膜過濾，與PDA按1∶10混合制平板。病原菌活化，打孔器(d=0.8 cm)沿邊緣打菌餅、倒扣在復篩平板中央，LB代替發酵液做對照，28 ℃培養4天，十字交叉法測量菌落直徑。抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

1.3.3 菌種鑒定

抑菌效果最好菌株BBs-27做分子鑒定。PowerSoilRDNA Isolation Kit試劑盒提取總DNA，用引物(PA：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′和PB：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)PCR擴增16S rDNA、測序，NCBI數據庫中搜索，選取近緣菌種，以大腸桿菌為外支，MEGA 7.0軟件中Muscle序列比對，選用Kimura2-parameter距離模型計算進化距離，采用Neighbor-Joining法構建系統發育樹(Bootstrap值=1 000)。

1.3.4 發酵液不同滅菌處理

BBs-27發酵液上清依次用0.45 μm、0.22 μm微孔膜過濾和121 ℃高溫處理15 min。

1.3.5 發酵條件優化

單因素有碳源、氮源，pH、溫度和時間。據單因素結果，選蔗糖、(NH4)2HPO4、時間和溫度為自變量，抑菌率為響應值，利用Design-Expert 8.0.5軟件進行4因素3水平Box-Behnken設計，其他條件為：LB為基礎培養基，pH=5，180 r/min。重復3次。

1.4 脂肽制備及對尖孢鐮刀菌形態影響

酸沉醇提法制備脂肽：7 mol/L鹽酸調pH=2，過夜沉淀；4 ℃、5 000 r/min離心20 min，甲醇多次抽提，蒸發濃縮，35 ℃真空干燥1天，稱重，計算產量。

配制10 mg/mL脂肽原液，過濾除菌，添加至PDA培養基中使脂肽終濃度為0.02～1 mg/L，按“1.3.2”方法抑菌試驗。菌絲噴金后用型號FEIQuanta-200掃描電鏡觀察菌絲形態和孢子。

1.5 數據處理與分析

Excel繪圖，Design-Expert 8.0.5軟件響應面設計，SPSS 18.0多重比較。

2 結果與分析

2.1 活性菌篩選

從4種組織中共分離到39株細菌，兩級篩選到13株有抑菌活性，抑菌率在5.77%～60.78%之間，其中27號菌抑菌率最高，根據編號和來源命名為BBs-27。

2.2 菌株鑒定

菌株BBs-27的16S rDNA序列在GenBank數據庫進行Blast，利用Mega7軟件進行聚類分析構建系統發育樹(見圖1)，與Bacillussubtilissubsp.subtilisstrain168相似性為98.93%，系統發育樹上屬同一分支，說明它們之間親緣關系最近。

2.3 發酵液不同處理方式對抑菌率影響

經過微孔濾膜過濾和濕熱高溫滅菌處理后的發酵液抑制率分別為56.12%和51.57%，說明高溫對抑菌物質活性有一定影響，但抑菌活性仍然較好，證明主要抑菌物質熱穩定性高。由于過濾處理操作費力費時、污染率高等，后期試驗用濕熱滅菌法除菌。

2.4 單因素試驗結果

2.4.1 碳源

以LB為基礎培養基，BBs-27發酵液抑菌率為51.57%，除了2.5%～3.0%木糖外，其他糖添加都能顯著提高抑菌率，尤其添加2.0%～2.5%蔗糖時其抑菌率顯著高于其他處理，而兩者之間差異不顯著(見表1)。

表1 不同碳源對抑菌率影響

2.4.2 氮源

LB中分別添加0.05%～0.2%的7種氮源，發酵物抑菌率在66.59%～80.39%之間都顯著性高于對照，0.05%(NH4)2HPO4時抑菌率最高，為80.39%，結果見表2。

表2 不同氮源對抑菌率影響

2.4.3 初始pH

初始pH對抑菌率影響見圖2，抑菌率會隨著pH增大先升高后降低，pH=5時發酵物的抑菌率最高，為74%，顯著高于其他pH。

圖2 初始pH對抑菌率影響

2.4.4 發酵溫度

發酵溫度會顯著影響抑菌物質合成(見圖3)，抑菌率隨著溫度升高先增大后減小，40～42 ℃的抑菌率顯著高于其他處理，但兩者之間差異不顯著。

圖3 發酵溫度對抑菌率影響

2.4.5 發酵時間

4個發酵時間的產物抑菌率有明顯差異(見圖4)，抑菌率隨著發酵時間延長先升高后降低，發酵96 h時，抑菌率最高，為58.82%。

圖4 發酵時間對抑菌率影響

2.5 響應面試驗結果

響應面試驗結果見表3和表4。

表3 Box-Behnken試驗設計與結果

表4 模型方差分析

2.5.1 回歸模型建立與分析

根據單因素實驗結果，選擇蔗糖、(NH4)2HPO4、溫度和時間四因素、三個水平，根據Box-Behnken設計原理構建響應面試驗設計(見表3)。1～24號是析因實驗，25～29號為中心實驗。

2.5.2 方差分析

利用Design Expert V8.0.6對表3數據多元回歸擬合分析，得回歸方程：Y=4585.03-28.79A-1401.75B-216.53C+3.00D+32.35AB-0.47AC+0.42AD+29.90BC+0.10BD-0.11CD+2.90A2+287.91B2+2.66C2+3.64×10-3D2。

表4所示，回歸模型極顯著(P<0.000 1)，失擬項P=0.153 1(>0.05)，說明模型失擬不顯著，R2=0.9551(>0.75)，Radj=0.910 2，說明模型擬合度較高，實驗誤差小，可用來分析和預測抑菌物質合成發酵條件。A、B、C、C2對抑菌率影響極顯著(P<0.01)；其次AD、BC和CD的影響顯著(P<0.05)。根據F值大小說明對抑菌率影響的大小順序依次為C>A>B>D。

2.5.3 發酵條件響應面分析及優化

為了更直觀探討上述因素之間的交互影響，固定任意兩個因素，考察另兩個因素間的交互作用，如圖5所示。根據響應面走勢、等高線密集，形狀，存在顯著交互作用的兩因素且從大到小依次是BC、CD和AD，其他相互作用不顯著。通過軟件分析得到最優化值為蔗糖2.49%、(NH4)2HPO40.01%，溫度40.14 ℃，發酵時間105.56 h，此條件下，模型預測抑菌率為88.82%。

圖5 兩因素交互對抑菌率影響的響應面圖

2.5.4 發酵參數修正及驗證試驗

為操作方便，實際工藝參數修正為2.5%蔗糖、0.01%(NH4)2HPO4，40 ℃，105 h。依據上述參數進行發酵抑菌試驗，抑菌率均值為88.06%，與預測值基本一致，相對誤差為0.86%，說明該模型能較好地預測抑菌物質產率，測產脂肽產量為0.6g(干重)/L。

2.6 脂肽對尖孢鐮刀菌生長影響

添加0.02～1 mg/L脂肽對尖孢鐮刀菌棉花枯萎?；偷囊志试?.71%～70.29%范圍內，根據線性方程Y=0.058 9X+21.202，脂肽的半抑菌率IC50為488.93 μg/L。脂肽對病原菌有明顯抑制作用，表現為菌落變小，縱向生長，顏色為淺黃色；而對照組菌絲中央為紅色，新長出菌絲為白色(見圖6)。電鏡觀察發現脂肽處理組菌絲膨大變形，粗細不均、有大量分生孢子(見圖7)，說明菌體處于逆境狀態，生長受到抑制。

圖6 脂肽對尖孢鐮刀菌抑菌效果

圖7 發酵液對尖孢鐮刀菌菌絲形態的影響

3 討論與結論

尖孢鐮刀菌能引起植物根腐病、枯萎病和黃化病[9]。用于棉枯病的生防菌主要有哈茨木霉TH-1[10]、綠色木霉GY20[11]、海洋鏈霉菌ZW-1[11]、壯觀鏈霉菌SC11[13]、短小芽孢桿菌[14]、解淀粉芽孢桿菌SN06[15]、蠟狀芽孢桿菌YUPP-10[16]等。因為尖孢鐮刀菌存在不同專化型和生理小種，本研究所用尖孢鐮刀菌病原菌從本校試驗田發病棉花植株中分離，屬于棉花萎蔫專化型，以抑制該病原菌的拮抗菌為篩選目標，從石豆蘭屬植物中篩選到一株具較好抑制作用的細菌，命名為BBs-27，分子鑒定與枯草芽孢桿菌亞種相似性最高。芽孢桿菌屬的很多種具有廣譜抗菌活性，具抑菌效果有枯草芽孢桿菌[17]、地衣芽孢桿菌[18]、瓦雷茲芽孢桿菌[19]、解淀粉芽孢桿菌[20]和蠟樣芽孢桿菌[21]等類型。

抑菌物質的發酵受培養基和環境因子影響較大[22]，通過優化培養基組成和發酵條件會提高抑菌物質產量。Liu等[23]用優化后的培養基發酵莫海威J7，抑菌物產量提高了38.89%，Chen等[24]優化了解淀粉芽孢桿菌SC1150菌株發酵培養基，對香蕉枯萎病4號生理小種的抑菌圈直徑由23.31增加到28.33。本研究中除了含2.5%～3.0%木糖培養基中沒有抑菌物質產生，其他糖添加都能促進抑菌物質產生；LB中只含有機氮，添加0.05%無機氮源(NH4)2HPO4能提高抑菌活性，優化后抑菌率由51.57%提高到88.06%，脂肽產量為0.6g(干重)/L，比枯草芽孢桿菌HS-A38及誘變菌株的產量均高[25]，Zhang等[26]對B.subtilisATCC2133產脂肽條件進行了優化，HPLC法測定含量為4.885 g/L，這可能因菌株及檢測方法有關。

產生抗菌脂肽微生物有多種，如細菌、放線菌、真菌等，其中芽孢桿菌是發現產脂肽最多的屬類，不同微生物產生的脂肽具不同結構、特性和不同抑菌效果[27]。本研究所用的BBs-27產生的抑菌物質有些耐高溫、有些高溫下失活，說明抑菌物質有多種，但主要抑菌物質是耐121℃高溫處理的。根據脂肽理化性質和本試驗脂肽的抑菌效果，推測出BBs-27產生的抑菌物質主要是脂肽。已開展的另一部分研究表明其他高溫失活的抑菌物質可能是蛋白質，抑菌蛋白的相關研究及脂肽結構等工作有待進一步開展。