高產蛋白酶和纖維素酶放線菌的篩選、鑒定及酶活測定

申術霞 孟慶偉 劉金璽 任彥慧

摘要：從含廢棄物土壤中分離篩選出一株同時產蛋白酶和纖維素酶的放線菌，并對其產酶活力進行測定，采用形態學和分子生物學對篩選菌株進行菌種鑒定。結果表明，篩選出的高產蛋白酶和纖維素酶的菌株GT-B-S001為嗜熱一氧化碳鏈霉菌，該菌株產蛋白酶活力為161.3U/毫升、產纖維素酶活力為135.5U/亳升。GT-B-S001有較強的產蛋白酶和纖維素酶的能力，具有較好的應用前景。

關鍵詞：蛋白酶；纖維素酶；嗜熱一氧化碳鏈霉菌；酶活力

近年來，伴隨社會經濟的發展和人口增長，人們對糧食數量和質量的高度追求，農業有機廢棄物也隨之大量產生。在大量生成的農業有機廢棄物中，占首位的是農業秸稈，其次為畜禽糞便。這些都制約了農業生產的發展，惡化了人類與大自然的和諧關系，而解決這一問題的根本途徑是開展農業有機廢棄物的資源化利用。

農用微生物正適應了現代農業發展的需求，利用微生物對有機廢棄物進行處理，來治理土壤污染、改善生態環境，使有益微生物菌群回歸自然，維護好土壤、生態的健康。利用微生物對有機廢棄物進行發酵，生產有機肥料又稱“堆肥”。它是指在微生物的作用下，通過高溫發酵使有機物得到分解、腐殖化和無害化的過程。在此過程中，會生成一些能被植物容易吸收利用的營養成分，同時合成一些能夠提高土壤肥力的新的有機物。而堆肥的研究重點是尋找產蛋白酶和纖維素酶能力強的菌株（細菌、真菌、放線菌等）。本研究從土壤中分離篩選得到一株高產纖維素酶和蛋白酶的放線菌，為進一步研究提供理論依據。

1.1 樣品

選擇常年覆蓋有農業有機廢棄物的土壤，取樣并將其裝入滅菌后的采樣袋中，-20℃保存備用。

1.2 培養基

蛋白酶篩選培養基：脫脂奶粉50.0克/升，瓊脂粉20.0克/升，113℃滅菌15分鐘。

纖維素酶篩選培養基：剛果紅纖維素培養基。高氏一號培養基：可溶性淀粉20克/升，硝酸鉀1克/升，磷酸氫二鉀0.5克/升，硫酸鎂0.5克/升，硫酸鐵0.01克/升，氯化鈉0.5克/升，p小時7.2～7.4。發酵培養基（g/ L）：羧甲基纖維素鈉（CMC），磷酸二氫鉀1.0克/升，氯化鈉0.1克/升，7水硫酸鎂0.3克/升，硝酸鈉2.5克/升，氯化鐵0.01克/升，氯化鈣0.1克/升，蛋白胨10.0克/升，蔗糖10.0克/升，氯化鈉5.0克/升，p小時 7.0～7.5。

1.3 產蛋白酶菌株的分離篩選

初篩：用無菌水對采集的樣品進行梯度稀釋，分別吸取200微升的10-3、10-4、10-4、10-6稀釋液均勻涂布于高氏一號培養基中，28℃培養48小時，挑取生長均勻的單菌落進行純化。挑取純化后的單菌落接種于蛋白酶篩選培養基，28℃培養48小時，觀察菌落周圍透明圈大小，挑選透明圈與菌落直徑比值較大的菌株為初篩菌株。

粗酶液的制備：初篩菌株接種于發酵培養基中，28℃、200轉/分鐘振蕩培養96小時，得到的發酵液于12000轉/分鐘離心20分鐘制備粗酶液，測定蛋白酶活力，選取酶活力較高的菌株為目標菌株。

1.4 蛋白酶活力的測定

采用Folin-酚法測定蛋白酶活力。將200微升粗酶液與200微升的2%酪蛋白溶液充分混勻，于40℃溫度下反應10分鐘后加入600微升的0.4摩爾/升的三氯乙酸終止反應，靜置10分鐘，12000轉/分鐘離心10分鐘制備上清液。取100微升上述制備的上清液，依次加入500微升的0.4摩爾/升的碳酸鈉溶液、100微升的福林酚試劑，充分混勻后于40℃溫度下保溫顯色20分鐘，在波長650納米下測定其吸光度。先加入三氯乙酸以終止反應的一組作為對照組。酶活定義：在pH7.0、溫度40℃的條件下，以每分鐘水解2%酪蛋白溶液所產生1微克的酪氨酸酶量作為1個酶活力單位（U/毫升）。

1.5 產纖維素酶菌株的分離篩選

將上述篩選得到的高產蛋白酶的菌株，經無菌水進行梯度稀釋后，涂布于剛果紅纖維素培養基中進行篩選，于28℃恒溫培養箱中培養，根據菌落形態選取挑選透明圈與菌落直徑比值較大的菌株，接種于發酵培養基中，28℃、200轉/分鐘振蕩培養96小時，得到的發酵液于12000轉/分鐘離心20分鐘制備粗酶液，測定濾紙酶（FPA）活性，對菌株進行復篩。

1.6 纖維素降解菌產酶活力測定

取一定量的粗酶液，加入含有50 毫克的CMC（或濾紙）、且pH為4.4的緩沖液中，55℃ 保溫1小時（或20分鐘），之后再加入二硝基水楊酸（DNS），沸水保溫顯色10分鐘后，冷卻至室溫，在波長550納米下測其OD值。酶活定義：將每分鐘產生1微摩的葡萄糖定義為一個酶活單位，用“U”表示。

1.7 高產蛋白酶和纖維素酶菌的鑒定

菌株形態鑒定：篩選得到的菌株GT-B-S001接種于高氏一號培養基平板中，28℃恒溫培養96小時，觀察菌落形態。挑取單菌落涂片、革蘭氏染色后顯微鏡下觀測其形態特征。分子鑒定：保存的菌株 GT-B-S001兩支斜面，送農業農村部微生物產品質量監督檢驗測試中心進行鑒定。

2.1 產蛋白酶菌株的篩選

從土壤中篩選出多株能夠產蛋白酶的菌株。通過比較水解圈直徑與菌落直徑的比值（R/r）和測定其蛋白酶活力，選擇R/r值為16/9的菌株GTB-S001（圖1）作為初篩菌株進行保存，經測定其蛋白酶活力為161.3U/毫升。

2.2 產纖維素酶菌株的篩選

將篩選所得高產蛋白酶菌株GT-B-S001在剛果紅纖維素培養基上培養，如圖2所示，菌落周圍有透明圈出現，并且R/r值為13/8。經測定該菌株產纖維素酶活力為135.5 U/毫升。

2.3 菌株GT-B-S001的鑒定

形態鑒定：菌株G T -B-S001在高氏一號培養基中，菌落顏色從最初的白色到成熟的灰色，菌落邊緣不光滑、微凸。革蘭氏陽性菌，孢子絲呈現直線或柔曲狀。初步判定為放線菌（圖3、圖4）。

分子鑒定：經鑒定，菌株GT-B-S001的16 sRNA序列與鏈霉菌（Streptomyces thermocarboxydus）同源性達99%，確定菌株GT-B-S001為嗜熱一氧化碳鏈霉菌（圖5）。

試驗結果表明，篩選出的高產蛋白酶和纖維素酶的菌株GT-B-S001為嗜熱一氧化碳鏈霉菌，該菌株產蛋白酶活力為161.3U/毫升、產纖維素酶活力為135.5U/毫升。GT-B-S001有較強的產蛋白酶和纖維素酶的能力，具有較好的應用前景。

作者簡介：申術霞（1989-），女，碩士研究生，中級工程師，研發員。主要從事微生物發酵及代謝產物的研究。