PI3K/Akt信號通路在SLE患者中性粒細胞胞外誘捕網形成中的作用

蔣瑤，祝靜，邢艷

(1.川北醫學院附屬醫院檢驗科；川北醫學院，2.醫學檢驗系；3.轉化醫學研究中心，四川 南充 637000)

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種經典的全身性自身免疫性疾病，在我國患病人數為全球之最，患病率高達(7.4～10)/10萬，男女發病比例約為1∶9[1]。SLE可由遺傳、激素、環境等多因素共同致病，但其發病核心在于自身抗原暴露、免疫耐受喪失，從而導致體內免疫調控紊亂[2]。而中性粒細胞作為啟動固有免疫的一線細胞，早期研究發現其凋亡異常可參與SLE發病[3]。近年來發現，中性粒細胞一種新的死亡形式—中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)，可釋放大量自身抗原參與SLE的發生。SLE患者體內NETs過度產生，但其分子機制不清[4]。PI3K/Akt信號通路參與調控多種細胞功能，包括代謝、生長、增殖、存活等[5]。研究[6]發現，PI3K/Akt信號通路的異常活化參與多種腫瘤發生發展，包括促進腫瘤細胞生長、浸潤等，但SLE患者體內NETs過度產生是否受PI3K/Akt信號通路的調控目前尚不明確。本研究擬運用佛波酯(PMA)、SLE混合血清、PI3K/Akt抑制劑及二者聯合刺激中性粒細胞，探討其在SLE患者體內NETs形成中的作用，為SLE疾病防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象 2019年2月至2019年12月川北醫學院附屬醫院就診的20例SLE活動期患者，全部病例均符合1997年美國風濕病學會(American College of Rheumatology，ACR)修訂的SLE分類診斷標準[7]，且所有研究對象無其他風濕性疾病及原發性急慢性疾病。SLE患者疾病活動度評分采用SLEDAI評分標準[8]。6例健康體檢者，均符合下列要求：(1)無SLE及其他自身免疫性疾病史和家族史；(2)無感染及慢性病史；(3)近期身體無任何不適。

1.1.2 試劑及主要儀器 PolymorphPrepTM多型核細胞分離液購自挪威axis-Ahield公司；Sytox?Green Nucleic Acid Stain購自美國Invitrogen公司；RPMI 1640培養基購自中國博士德公司；LY294002(PI3K抑制劑)、MK2206(Akt抑制劑)購自中國碧云天公司；CD45-PerCP購自美國BD公司；PMA購自美國sigma公司；臺盼藍染色液(0.4%)購自中國Solarbio公司；瑞氏-姬姆薩染液購自珠海貝索生物公司；倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；流式細胞分析儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 中性粒細胞分離 采集健康體檢者外周靜脈血10 mL，2 h內用密度梯度離心法分離中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)，PBS洗滌3次后，用2 mL細胞培養液RPMI 1640重懸細胞。

1.2.2 PMN純度及活性鑒定 取上述10 μL PMN懸液均勻涂抹在玻片上，利用瑞氏-吉姆薩染液進行染色，自然風干后顯微鏡下計數PMN所占比例。取100 μL上述PMN細胞懸液及4 μL CD45-PerCP到流式管內，重復孵育-洗滌操作3遍后，PBS重懸細胞后在流式分析儀上分析細胞純度。取90 μL上述PMN懸液與10 μL濃度為0.4%臺盼藍溶液于EP管內混勻，后吸取10 μL到牛鮑計數板上，顯微鏡下計數未藍染細胞所占比例。

1.2.3 SLE患者混合血清收集 采集SLE患者全血4 mL于無抗凝劑采血管內，8 h內250 g離心5 min后留取上清，-80 ℃保存待用。

1.2.4 PI3K抑制劑(LY294002)及Akt抑制劑(MK2206)處理PMA和SLE混合血清 吸取上述分離得到的3×105個PMN到24孔板，分為抑制組、抑制劑+PMA組、PMA組及抑制組、抑制劑+SLE混合血清組、SLE混合血清組，每組3個復孔，毎孔500 μL。具體分組處理為：(1)抑制組：加入10 μM LY294002或25 nM MK2206；(2)抑制劑+PMA組：加入10 μM LY294002或25nM MK2206處理30 min后，再給予2 nM PMA刺激90 min；(3)PMA組：加入2 nM PMA；(4)抑制劑+SLE混合血清組：加入10 μM LY294002或25 nM MK2206處理30 min后，再加入100 μL SLE混合血清刺激120 min；(5)SLE混合血清組：加入100 μL SLE混合血清。在孵育結束前30 min，各孔加入5 μM Sytox Green，孵育相應時間后，各組同步結束并上機檢測各孔熒光強度。

1.2.5 PI3K抑制劑(LY294002)及Akt抑制劑(MK2206)處理PMN 吸取上述分離得到的3×105個PMN到24孔板，以不加入或加入10 μM LY294002及25nM MK2206分別作為對照組及處理組，每組3個復孔，毎孔500 μL，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱培養90 min后上機檢測各孔熒光強度。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 分離的PMN純度及活性

分離PMN后，經瑞士染色在光學顯微鏡下分類計數200個白細胞，PMN純度>95%；流式細胞術檢測PMN純度>95%；臺盼藍拒染實驗檢測發現分離的PMN活性>95%，達到體外細胞實驗要求。見圖1。

2.2 LY294002抑制PMA和SLE混合血清刺激PMN形成NETs

PMN在加入或不加入PI3K抑制劑LY294002或PMA刺激情況下，檢測到各組NETs水平分別為：LY294002組(168±78.08)、LY294002+PMA組(310±182.77)、PMA組(840.20±334.54)，即LY294002能明顯抑制PMA刺激的NETs形成(P=0.005)；PMN在加入或不加入PI3K抑制劑LY294002或SLE混合血清刺激的情況下，檢測到各組NETs水平分別為：LY294002組(269.33±141.51)、SLE血清+LY294002組(419.33±196.83)、SLE血清組(703±266.71)，表明LY294002能明顯抑制SLE血清誘導的NETs形成(P=0.004)。見圖2。

2.3 MK2206抑制PMA和SLE混合血清刺激PMN形成NETs

PMN在加入或不加入Akt抑制劑MK2206或PMA刺激的情況下，檢測到各組NETs水平分別為：MK2206組(130.20±53.18)、MK2206+PMA組(593±224.93)、PMA組(842.60±307.04)，即MK2206能明顯抑制PMA刺激的NETs形成(P=0.007)；PMN在加入或不加入Akt抑制劑MK2206或SLE混合血清刺激的情況下，檢測到各組NETs水平分別為：MK2206組(279.33±92.24)、MK2206+SLE混合血清組(500.67±271.53)、SLE混合血清組(784.50±348.28)，即MK2206能明顯抑制SLE混合血清誘導的NETs形成(P=0.009)。見圖3。

2.4 MK2206抑制PMN自發形成NETs

與對照組相比，Akt抑制劑MK2206與PMN共培養90 min后的NETs水平降低[(138.67±52.11)vs.(210.33±80.66)，P=0.03]，表明MK2206能通過抑制Akt活化而減少NETs的自發形成；但PI3K抑制劑LY294002無此作用[(168±78.08)vs.(220.60±87.03)，P=0.15]，表明在PMN自發形成NETs的過程中，有活化Akt的參與，但其上游調控蛋白可能不是PI3K。見圖4。

3 討論

SLE是一種全身性自身免疫性疾病，可累及多個器官組織，以自身抗原暴露、免疫耐受缺失和免疫調控紊亂為特點，以免疫復合物沉積、結締組織炎癥和血管病變為基本病理改變。NETs作為近年來發現的中性粒細胞的一種區別于凋亡和壞死的細胞死亡形式，其結構特點是以DNA為基本骨架，上面附著有多種蛋白酶和抗菌肽[9]。基于NETs獨特的結構特點，首先被發現在殺滅入侵的病原體方面具有重要作用，隨后研究發現其可作為自身抗原而參與SLE發病[10-11]。故可通過研究NETs形成的分子機制找到其關鍵信號分子，從而減少機體內NETs形成，為SLE的防治提供依據。

近年來，關于NETs形成相關分子機制研究已有報道，當抑制TAK1、p38 MAPK及MEK通路后中性粒細胞形成的胞外染色質細絲短，且幾乎沒有相互連接，但對染色質的釋放影響較小，從而調控了NETs的早期形成，而Syk和PI3K蛋白抑制劑處理中性粒細胞后，幾乎沒有染色質排出，表明其參與了NETs的后期形成過程[12]。有學者在此基礎上進一步研究了相關靶點藥物，Yao等[13]研究發現，中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑ONO-5046能通過抑制ROS產生而減少LPS誘導的NETs形成，從而減輕炎癥癥狀，此外，丙泊酚也可通過抑制p-ERK和HOCl產生而減少PMA誘導的NETs形成[14]。故研究參與NETs形成的信號通路對疾病治療藥物的研發有重要意義。

21世紀初有學者發現NETs參與了SLE的發病過程，本小組前期研究也發現SLE患者外周血中性粒細胞NETs形成增強，并可能與疾病的活動度相關[15]，但SLE患者體內NETs過度形成的分子機制仍不清。PI3K/Akt信號通路參與調控多種細胞功能，包括代謝、生長、增殖、存活等，其異常活化不僅參與多種腫瘤的發生發展，還能通過導致胰島素抵抗及影響骨骼肌、脂肪組織、肝臟、大腦等組織器官的作用而參與肥胖和2型糖尿病等代謝性疾病的發病過程[4,16]。此外，還有學者發現脂多糖(LPS)可通過激活PI3K/Akt信號通路而促進中性粒細胞對大腸桿菌的吞噬作用[17]，LPS是可刺激NETs形成的誘導劑，那么此過程也可能是LPS通過促進中性粒細胞形成NETs而達到增強其吞噬的功能。此外，PI3K/Akt也是經典的抗凋亡通路蛋白，而NETs作為中性粒細胞的一種異于凋亡的細胞死亡形式，抗凋亡蛋白PI3K/Akt是否參與了這一過程？據此，本實驗研究發現在NETs經典強效誘導劑—PMA的作用下，PI3K/Akt特異性抑制劑—LY294002/MK2206均可減少PMA刺激形成的NETs，表明在NETs形成過程中有PI3K/Akt活化的參與。此外，還有研究[18]發現，SLE混合血清因含有大量炎性因子和自身抗體而可作為誘導PMN形成NETs的生理誘導劑，但參與其中的分子機制不明。本研究進一步探究了PI3K/Akt在SLE混合血清刺激PMN形成NETs中的作用，發現PI3K/Akt特異性抑制劑通過抑制PI3K/Akt信號蛋白的活化而參與SLE混合血清誘導的NETs形成。我們還發現當加入Akt抑制劑后，PMN自發形成的NETs水平降低，但PI3K特異性抑制劑無此作用，表明PMN在自發形成NETs過程中有Akt的活化，但仍需進一步分析其上游調節蛋白。

綜上所述，PI3K/Akt抑制劑能抑制PMA及SLE混合血清刺激PMN形成NETs，故推測PI3K/Akt參與了SLE患者體內NETs的形成。但PI3K/Akt在SLE患者體內NETs形成中的作用仍需進一步實驗證實，其能否作為靶點藥物還需進一步探索。