移動元件ISEcp1介導blaCTX-M轉座機制的分析研究*

劉 東，張 倩，王倩薇，毛英格，王 麗

(河南大學第一附屬醫院檢驗科，河南開封 475001)

近年來，臨床細菌耐藥問題已嚴重危及公眾健康，給臨床治療帶來巨大挑戰。2016年9月5日在中國杭州舉辦了全世界矚目的G20峰會，會中明確提出抗生素耐藥性嚴重威脅公共健康、經濟增長和全球經濟穩定。而產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)是臨床細菌耐藥的重要原因之一，且CTX-M為主要型別。根據氨基酸序列的異質性，可將其分為6個亞群，即Group 1、Group 2、Group 8、Group 9、Group 25和KLUC Group[1]，其中Group 1和Group 9是包含CTX-M型ESBLs變種較多的亞群，也是全世界范圍內最主要的流行群。不同亞群間氨基酸變異率大于或等于10%，同一亞群內氨基酸變異率小于或等于5%。

表1 GenBank中典型ISEcp1轉座單元

-：無數據

遺傳證據顯示，blaCTX-M的初始來源是環境菌株克呂沃爾菌的染色體，具有豐富的環境資源，進而傳遞給臨床菌株[1]。blaCTX-M通常位于ISEcp1下游，形成ISEcp1轉座單元，或與ISCR1關聯位于1型整合子中[2]，也有報道顯示blaCTX-M的轉移與噬菌體有關[3]。與blaCTX-M相關的轉座單元或其他元件通常位于質粒上，同一菌株可含有1種以上的blaCTX-M，分別位于不同質粒上或同一質粒的不同位點。ISEcp1屬于IS1380家族，左端重復序列(inverted repeat left，IRL)和右端重復序列(inverted repeat right，IRR)長度均為14 bp，二者有兩個堿基差異，編碼420個氨基酸的轉座酶(transposase，tnpA)。ISEcp1轉座單元的完整結構為：IRL、tnpA、IRR-1和IRR-2。IRR-2與IRL和IRR-1的序列同源性略低，IR的兩端通常會有5 bp正向重復序列(direct repeat；target site duplication signals for transposition，DR)[4]。ISEcp1可借助IRL和IRR-2轉移其臨近的DNA序列，且該DNA序列往往包含耐藥基因[5]，blaCTX-M就是其中較為常見的一種[6]。該轉座方式大大促進了blaCTX-M的水平轉移，進一步促進了其在全球范圍內的播散。產ESBLs革蘭陰性菌引發的耐藥現象已嚴重危及公眾健康，且CTM-M為主要類型，因此開展CTX-M型ESBLs相關的分子耐藥機制方面的研究，具有很大的必要性。本文主要從ISEcp1轉座單元的類型及其轉座機制兩個方面進行研究，以期為臨床防控和治療提供分子依據。

1 材料與方法

1.1分析工具 NCBI網站BLASTN/BLASTP，ResFinder，ISfinder，Inkscape 0.48.1等生物信息學工具或數據庫。

1.2方法 截取ISEcp1和blaCTX-M的序列(二者均有亞型，亞型間同源性較高，選取質粒p112298-KPC[7]中相應的ISEcp1和blaCTX-M序列)，在NCBI網站BLAST入口提交檢索與該序列相似的序列，篩選不同種類的側翼序列。通過ResFinder(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)預測耐藥基因，BLASTN/BLASTP等對ORF和假基因進行核實與信息完善，并利用ISfinder(https://www-is.biotoul.fr/)對移動元件進行精細注釋，最后運用Inkscape 0.48.1(https://inkscape.org/en/)繪圖。

2 結 果

2.1GenBank中典型ISEcp1轉座單元匯總 GenBank中典型ISEcp1轉座單元的相關信息，見表1。ISEcp1轉座單元主要可分為6類，即ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉座單元(常見于blaCTX-M-1G、blaCTX-M-25G和雜合體)、ISEcp1-blaCTX-M-IS903-ΔiroN轉座單元(常見于blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G)、ISEcp1-blaCTX-M轉座單元(常見于blaCTX-M-1G)、ISEcp1-blaCTX-M-orf3轉座單元(常見于blaCTX-M-9G)、ISEcp1-blaCTX-M-orfX轉座單元(常見于blaCTX-M-25G)和ISEcp1-blaCTX-M-ΔIS26-orf222轉座單元(常見于blaCTX-M-9G)。

箭頭：基因；基因、移動元件和其他特征根據功能分類進行著色；序列兩端的黑色長條：檢索到的序列不完整；陰影：同源性區域(>95%核苷酸一致性)

圖1 GenBank中典型ISEcp1轉座單元繪圖及比對

2.2GenBank中典型ISEcp1轉座單元繪圖及比對 通過對6類ISEcp1轉座單元進行精細結構分析及繪制圖譜，分別得到了相應的結構圖，見圖1。完整的ISEcp1轉座單元包含IRL、IRR-1和IRR-2，且在IRL和IRR-2的兩端通常會有DR。以ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉座單元為例(圖1a)，其轉座單元的線性結構為DR-IRL-tnpA-IRR-1-blaCTX-M-Δorf477-IRR-2-DR，其中上游tnpA為轉座酶編碼基因，下游為截短的orf477(編碼一種功能未知的蛋白)。另5種轉座單元的結構的5′端均與ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉座單元相同，彼此間的差異僅在于blaCTX-M下游，ISEcp1捕獲了不同的基因，形成了不同的結構。

2.3ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉座單元間距示意圖 ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉座單元中ISEcp1與blaCTX-M間距主要有以下8種類型，分別是37、45、47、48、49、79、80和127 bp，見圖2。

圖2 ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉座單元中ISEcp1與blaCTX-M間距(spacer)示意圖

3 討 論

自β-內酰胺類抗生素廣泛應用于臨床以來，β-內酰胺酶陸續被報道，且其種類逐年增加。其中ESBLs主要是由革蘭陰性桿菌在超廣譜β-內酰胺類抗生素的選擇壓力下產生的一種β-內酰胺鈍化酶，具有廣泛的水解酶活性[8]。目前ESBLs已廣泛存在于大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌、腸道沙門菌及其他腸桿菌科菌中[9]。ESBLs種類很多，20世紀60年代，發現質粒介導的ESBLs，即TEM-1[10]；另一個較為常見的質粒介導的ESBLs是SHV-1，自此TEM-1、SHV-1及其變種開始在全世界范圍內廣泛傳播。1989年德國首次報道了CTX-M-1[11]，之后CTX-M型ESBLs迅速在全球范圍內傳播，成為目前ESBLs流行中最常見且傳播最廣的類型。

ISEcp1轉座單元是blaCTX-M傳播的重要載體，本研究顯示，ISEcp1轉座單元結構主要可分為6類，即：ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477、ISEcp1-blaCTX-M-IS903-ΔiroN、ISEcp1-blaCTX-M、ISEcp1-blaCTX-M-orf3、ISEcp1-blaCTX-M-orfX和ISEcp1-blaCTX-M-ΔIS26-orf222。最常見的ISEcp1-blaCTX-M-orf477轉座單元在blaCTX-M的下游是截短的orf477(編碼一種功能未知的蛋白)[12-14]。另一種較為常見的轉座單元是ISEcp1-blaCTX-M-IS903-ΔiroN轉座單元，即在blaCTX-M的下游為IS903和iroN(編碼鐵外膜轉運蛋白)[7，15]。ISEcp1-blaCTX-M轉座單元在blaCTX-M-2的下游有一段256 bp的序列，該序列和抗壞血酸克呂沃爾菌中kluA-1下游堿基一致[16]。ISEcp1-blaCTX-M-16-orf3轉座單元，在blaCTX-M-16的下游為orf3(編碼一種功能未知的蛋白)[17]。ISEcp1-blaCTX-M-26-orfX轉座單元在blaCTX-M-26的下游是orfX(289 bp，該序列不完整)[18]。ISEcp1-blaCTX-M-14b-ΔIS26-orf222轉座單元在blaCTX-M-14b的下游有108 bp的IS26殘留和orf222(編碼一種功能未知的蛋白)[19]。

完整的轉座單元通常會在IRL和IRR-2的兩端形成5 bp DR，如TACTA、TAATA、AATAC等，是轉座事件發生的標志。該轉座方式促進了blaCTX-M的高水平表達和跨種屬、跨物種和跨地區傳播。細菌中基因的表達調控主要發生在轉錄水平上，啟動子在該過程中居于關鍵地位，決定相應蛋白的表達水平。ISEcp1轉座單元中blaCTX-M的高水平表達與ISEcp1中的啟動子(P1)密切相關，此外還和ISEcp1與blaCTX-M的間距(spacer)有關[20-21]。本研究顯示，ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉座單元中ISEcp1與blaCTX-M間距主要有以下8種類型，分別是37、45、47、48、49、79、80和127 bp。研究表明，不同間距包含的啟動子類型和效應是不同的[20-21]。以ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉座單元為例，ISEcp1與blaCTX-M的間距為37～127 bp。不同間距的轉座單元均包含P1，有完整的-35區、-10區、-35區和-10區之間的間隔序列和轉錄起始位點，促進下游blaCTX-M的表達。但僅79、80和127 bp間距的轉座單元具有P2活性，其他間距的轉座單元中由于不同長度的堿基缺失，導致P2中-35區的缺失，進而影響P2活性[22]。與P2相比，P1活性較強，為強啟動子，在促進下游基因的表達中占據主導地位[23]。綜合來說，P1活性和短間距是促進下游blaCTX-M高水平表達的關鍵因素。

blaCTX-M的表達存在“基因沉默”現象，當僅有blaCTX-M存在時，該基因不表達或表達水平較低。在外界藥物的壓力下，ISEcp1轉座插入到blaCTX-M上游，為其提供強啟動子區，可促進blaCTX-M的高水平表達，進而使得菌株獲得相應耐藥表型[24]。且一旦ISEcp1轉座插入到blaCTX-M上游形成完整的轉座單元，便可在不同的遺傳物質間傳播，從染色體到質粒，質粒與質粒之間，進而在同種或不同種細菌間快速傳播，導致耐藥性播散。