IRF1受到miR-23a調控抑制舌鱗癌細胞增殖并促進凋亡

孫繼紅, 柳 雪, 陶亞東, 劉 慧, 霍 峰， 武俊華, 徐樹雷

(1.承德醫學院校醫院， 河北 承德 067000 2.承德醫學院附屬醫院， 河北 承德 067000 3.河北省軍區承德離職干部休養所， 河北 承德 067000)

在常見的惡性腫瘤中頭頸部腫瘤排名第六位，90%為頭頸部鱗狀細胞癌和口腔鱗狀細胞癌[1]。其中口腔舌鱗狀細胞癌(oral tongue squamous cell carcinoma，OTSCC)是最常見的口腔鱗狀細胞癌。根據腫瘤調查統計數據，口腔癌的5年生存率約為53%，而口腔舌鱗癌的5年生存率僅為33%～40%[2]。OTSCC通常根據臨床癥狀，淋巴結腫大和遠處轉移情況評估腫瘤，并進行治療計劃分期[3]。但是這種分期系統不能為早期OTSCC提供準確的預測。因此，我們要尋找更可靠的預后標志物，以便更好地鑒別早期OTSCC具有侵襲性行為。證據顯示20%～40%的患者在發病前已經有隱匿性轉移[4]。干擾素調節因子(interferon regulatory factor,IRF)是一類重要的轉錄調節因子，該家族基因主要由IRF1-IRF9等9個成員組成。干擾素調節因子-1 (Interferon regulatory factor-1,IRF1)是IRF家族的一種腫瘤調節因子，調節干擾素的表達[5]。隨著研究的深入，IRF1在炎癥、免疫反應、細胞增殖、細胞周期進展、T細胞分化和DNA損傷期間的基因表達調控中的功能越來越多被報道被揭示。IRF1基因改變和/或低表達與較差的臨床結果、較高的癌癥易感性和較低的免疫治療應答有關，提示IRF1在白血病、乳腺癌、宮頸癌和結直腸癌等多種癌癥類型中具有抑癌作用[6]。然而，IRF1在肝癌和食管癌中的致癌能力最近有報道[7]。這些研究表明IRF1在癌癥中起到抑癌基因的作用，并且與癌癥類型相關。在本研究中，我們發現IRF1在口腔舌鱗癌細胞中表達顯著降低。而且過表達IRF1后可以抑制口腔舌鱗癌細胞的增殖，并促進細胞凋亡。故此我們大膽推測IRF1在口腔舌鱗癌細胞中起到抑癌基因作用，并且進一步探求了IRF1的上游表達調控因子，以期能夠揭示IRF1在口腔舌鱗癌細胞中的作用機制，為口腔舌鱗癌細胞的早期診斷和治療提供分子依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器：(1)Tca-8113細胞:(天津賽爾生物技術有限公司);(2) IRF1過表達和敲降質粒:(天津賽爾生物技術有限公司);(3) 胰蛋白酶：(GIBCO BRL,美國);(4) 1640培養基:(GIBCO BRL,美國);(5)Opti-MEM:(GIBCO BRL，美國);(6)乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2):(天津市化學試劑批發公司);(7) PBS (含137 mmoL/L NaCl,2.7 mmoL/L KCl,10 mmoL/L Na2HPO4,2 mmoL/L KH2PO4);(8) 胎牛血清(FBS):(GIBCO,美國);(9)6孔,12孔,24孔培養板,T25細胞培養瓶:(Orange Scientific,比利時);(10)CO2恒溫培養箱:(Thermo Forma,美國);(11)5415D型離心機:(Eppendorf,德國);(12)TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒:(Roche,瑞士) ;(13)脂質體Lipofectamine2000 Reagent:(Invitrogen,美國);(14)12對口腔舌鱗癌組織及其癌旁正常組織:(承德醫學院附屬醫院口腔科)。

1.2細胞轉染:首先進行細胞接種，100萬個細胞接種至25mL細胞培養瓶中，培養過夜，次日轉染。質粒的質量(μg)與脂質體的體積比例為1∶1，配制好質粒與脂質體混合物后，靜置20min后再加入細胞培養瓶中。轉染4h后，更換細胞培養液。

1.3TUNEL方法:細胞轉染后24h，調整細胞濃度，按照4000個/孔接種14孔板。每組實驗設置3個副孔。待細胞貼壁后，加0.1ppc的紫杉醇誘導凋亡1h。處理標志為：細胞部分變圓，部分形態正常。樣本固定：待6孔板中細胞晾干之后，每孔加入1mL新鮮配制的固定液室溫15～25℃固定細胞1h， (固定液：4%多聚甲醛溶于PH7.4 的PBS 中，新鮮配制); 漂洗；加入1mL封閉液，室溫15～25℃封閉10min；(封閉液：無水甲醇稀釋的3%H2O2)。漂洗；加入1mL通透液，冰上放置2min；(通透液：0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉，需新鮮配制)。制作陽性對照樣本：樣本在Triton X-100通透液處理、PBS浸洗后，用DNA酶1反應液，處理30min。配制TdT酶反應液：平衡液 45μL，熒光標記液1μL，TdT 酶 4μL，共50μL 。標記：漂洗2次； 標記 60min；漂洗；染色5min。熒光顯微鏡下觀察，可以使用的激發波長范圍為450～500nm，發射波長范圍為515～565nm(綠色熒光)；凋亡指數是指每張TUNEL陽性切片選取5個陽性細胞(表達綠色熒光的細胞為陽性)數最多的高倍視野(400)，計算500個舌鱗癌細胞中陽性細胞所占的百分比。

1.4實時定量PCR實驗(Real-time PCR):混勻后37℃1min，50℃ 60min，70℃ 15min。cDNA產物置于冰盒中待用，或-20℃保存備用。①按照所需用量增加配比體積。配置比例如下：2 × Master Mix，5μL；10uM 的PCR特異引物F，0.5μL；10uM 的PCR特異引物R，0.5μL水，2μL。②加樣 取8μL混合液分別加入至每個孔中，再按照實驗分組分別加入相應的cDNA，2μL/孔；封膜，混勻，瞬離；置于冰板上備用。③設置如下反應程序：95℃，8min；95℃，10s；60℃，60s；42個循環。④計算結果:收集結果，實驗中設置5個副孔，去掉最高值和最低值，取3個副孔的平均數，采用2-△△Ct法分析數據。Folds=2-△△Ct，△△Ct=(Ct1～Ct2)-(Ct3～Ct4)

1.5MTT實驗:細胞轉染18h后，消化，計數，以每孔6000個細胞種于96孔板，在細胞轉染后不同天數的同一時間進行檢測，依此加入MTT液與DMSO，然后測定A570。實驗中設置5個副孔，去掉最高值和最低值，取3個副孔的平均數。

1.6熒光報告載體實驗:通過Targetscan軟件預測到miR-23a可以與IRF1 3’UTR相結合，結合位點序列為：AATGTGA，將該序列突變為TAAGAGT。將包含結合位點長度為150bp的野生型和突變型IRF1 3’UTR(IRF13’UTR,IRF1 3’UTR mut)構建到pCD3/EGFP載體中。以50nmoL/L ASO-NC,ASO-23a,或者200ng pcDNA3,pri-miR-23a和IRF13’UTR,IRF13’UTR mut質粒共轉24孔板中的Tca8113細胞，并添加1.0μL Lipofectamine 3000轉染試劑，轉染4h后換液；轉染48h后收集細胞進行裂解，并利用雙熒光素酶試劑盒進行分析。實驗中設置5個副孔，去掉最高值和最低值，取3個副孔的平均數。

1.7Western blot:裂解細胞，取上清液。配制10%凝膠，上樣，分離，轉膜，封閉，加入抗體，IRF1抗體和GAPDH抗體分別按照1∶200和1∶500的比例加入相應的膜中，置于4℃過夜。次日洗膜后，將二抗按照1∶1000的比例加入膜中室溫作用2h。曝光，照相。用LabWorks TM凝膠成像及分析系統對膠片進行攝像，軟件分析得到各組蛋白條帶亮度值，并以對照組為標準值1，繪制柱狀圖。實驗均重復3次。

2 結 果

2.1IRF1在舌鱗癌組織中表達水平降低:結果顯示，與癌旁正常組織相比，IRF1在舌鱗癌組織中表達平均下降至對照組的38%，最低下降至11%，其中有一例下降至對照組98%(圖1)。結果表明在12對舌鱗癌組織中，與癌旁組織相比，IRF1的表達水平明顯下降，差異有統計學意義。

圖1 12對舌鱗癌組織中IRF1的表達水平Real-time PCR檢測舌鱗癌組織及其癌旁組織中的IRF1。

2.2IRF1 抑制舌鱗癌細胞的生長活性:由于IRF1在舌鱗癌組織中表達降低，我們構建了IRF1的過表達質粒，通過細胞轉染提升Tca8113細胞內的表達水平。如圖2所示，過表達IRF1后，Tca8113細胞的生長活性與對照組相比明顯下降，差異有統計學意義。轉染后24h檢測細胞活性，過表達IRF1組下降至對照組的87%；轉染后48h檢測細胞活性，過表達IRF1組下降至對照組的75%；轉染后72h檢測細胞活性，過表達IRF1組下降至對照組的61%。上述結果表明IRF1可以抑制舌鱗癌細胞的生長活性。

圖2 IRF1對Tca8113細胞生長活性的影響在Tca8113細胞中轉染IRF1過表達質粒后，分別在24h，48h，72h應用MTT實驗檢測細胞的生長活性。

2.3IRF1促進舌鱗癌細胞的凋亡:基于以上結果，IRF1在舌鱗癌組織中表達異常降低，且IRF1可抑制舌鱗癌細胞的生長活性。我們應用紫杉醇誘導細胞凋亡(濃度為0.1ppc)，在細胞轉染后24h加入紫杉醇，誘導凋亡1h，通過TUNEL實驗檢測IRF1對舌鱗癌細胞凋亡的影響。如圖3A所示，過表達IRF1后，IRF1過表達組比IRF1-對照舌鱗癌細胞Tca8113的凋亡細胞明顯增加，凋亡指數由0.9%增加到8.4%(圖3B)，差異有統計學意義。結果表明IRF1可以促進舌鱗癌細胞的凋亡。

圖3 IRF1對Tca8113細胞凋亡的影響(A)在Tca8113細胞中轉染IRF1過表達質粒，轉染后加入0.1ppc紫杉醇誘導24h后，拍照檢測凋亡細胞數目。(B) 對視野內的細胞計數并統計出凋亡指數。

2.4IRF1是miRNA-23a的直接靶基因:如圖4所示，生物信息學軟件預測miR-23a的種子序列可以與IRF1的3’UTR相結合。IRF1野生型的3’UTR與miR-23a有7個結合位點，也稱作種子序列。我們將野生型的IRF1 3’UTR構建熒光報告質粒pcDNA3-EGFP-IRF1 3’UTR。 我們將種子序列中突變了四個位點， 作為突變型的IRF1 3’UTR mut，構建熒光報告質粒pcDNA3-EGFP-IRF1 3’UTRmut。用于接下來的熒光報告載體實驗。如圖5所示，我們將野生型熒光報告載體pcDNA3-EGFP-IRF1 3’UTR，圖中簡寫為EGFP-IRF1 3’UTR轉染進舌鱗癌細胞Tca8113中，同時過表達miR-23或封閉miR-23a，結果顯示過表達miR-23a后，pri-miR-23a組比pcDNA3組熒光強度降低了55%；封閉miR-23a后，ASO-23a組比ASO-NC組熒光強度增強了1.7倍，差異有統計學意義。我們將突變型的熒光報告載體pcDNA3-EGFP-IRF1 3’UTRmut，同時過表達或者封閉miR-23a，結果顯示，pri-miR-23a組比pcDNA3組熒光強度增強1.1倍；封閉miR-23a后，ASO-23a組比ASO-NC組熒光強度降低至97%，兩組差異均無統計學意義。綜上，熒光實驗結果顯示miR-23a可以直接靶定IRF1 3’UTR野生型，并且抑制其下游的熒光基因表達，導致熒光表達降低。

圖4 miR-23a與IRF1mRNA3‘UTR相結合的種子序列以及突變型

圖5 熒光報告載體實驗結果構建IRF13’UTR的野生型及突變型熒光報告載體，轉染進舌鱗癌細胞中，同時過表達或者封閉miR-23a檢測各組熒光強度

2.5舌鱗癌組織中miR-23a的表達水平:如圖6所示，我們用實時定量PCR檢測miR-23a的表達水平，在12對舌鱗癌組織中結果顯示，在舌鱗癌組織中miR-23a表達升高，癌組織與癌旁正常組織相比miR-23a的表達水平平均升高32.5倍，最低9.2倍，最高57.4倍，差異有統計學意義。結果表明，在舌鱗癌組織中miR-23a的表達水平異常升高，起致癌基因作用，促進舌鱗癌發生發展。

圖6 miR-23a在舌鱗癌組織中的表達水平應用real-time PCR檢測miR-23a在舌鱗癌組織中的表達水平

2.6封閉miR-23a表達后，舌鱗癌細胞活性明顯降低:上述結果顯示IRF1在舌鱗癌組織中水平異常降低，上游受miR-23a調控，在舌鱗癌組織中miR-23a表達水平升高。我們大膽推測升高的miR-23a通過靶定IRF1的3‘UTR降低了IRF1的表達水平。我們合成了miR-23a的反義寡核苷酸序列ASO-23a，以此封閉舌鱗癌細胞中異常高表達的miR-23a，無意義序列ASO-NC作為對照。將ASO-23a轉染進Tca8113細胞后，ASO-23a與細胞內高表達的miR-23a相結合，解除了miR-23a對IRF1的負性調控。我們應用MTT實驗檢測封閉miR-23a后，舌鱗癌細胞活性的改變。如圖7所示，轉染24h后檢測舌鱗癌細胞的生長活性，與ASO-NC組相比，ASO-23a組下降了14%；轉染48h后檢測舌鱗癌細胞的生長活性，與ASO-NC組相比，ASO-23a組下降了24%；轉染72h后檢測舌鱗癌細胞的生長活性，與ASO-NC組相比，ASO-23a組下降了39%(圖7)。結果表明，與ASO-NC組相比，ASO-23a組的細胞活性明顯下降，且差異有統計學意義。封閉miR-23a與過表達IRF1的細胞活性檢測結果一致，都降低舌鱗癌細胞的生長活性。

圖7 封閉miR-23a后MTT的實驗結果在Tca8113細胞中轉染ASO-23a和ASO-NC，在轉染后24h，48h和72h檢測舌鱗癌細胞的生長活性。

2.7封閉miR-23a表達后，舌鱗癌細胞的凋亡明顯增強:我們應用紫杉醇誘導細胞凋亡(濃度為0.1ppc)，在細胞轉染后24h，將細胞轉接種至14孔板中，加入0.1ppc紫杉醇，藥物誘導細胞凋亡作用1h后，通過TUNEL實驗檢測IRF1對舌鱗癌細胞凋亡的影響。我們封閉細胞內源性miR-23a后應用TUNEL實驗檢測舌鱗癌細胞的凋亡活性。如圖8所示，與ASO-NC組相比，ASO-23a組的細胞凋亡數目明顯增加，且差異有統計學意義。如圖8A所示，封閉miR-23a后，ASO-23a組比ASO-NC組舌鱗癌細胞Tca8113的凋亡細胞明顯增加，凋亡指數由1.2%增加到7.8%(圖8B)，差異有統計學意義。結果表明封閉miR-23a與過表達IRF1所得的結果一致，都可以促進舌鱗癌細胞的凋亡。

圖8 封閉miR-23a后TUNEL的實驗結果在Tca8113細胞中轉染ASO-23a和ASO-NC，在轉染后的24h應用0.1ppc紫杉醇誘導細胞凋亡1h。(A)用熒光顯微鏡拍照計數凋亡細胞的數目。(B) 對視野內的細胞計數并統計出凋亡指數。

3 討 論

本研究發現IRF1在舌鱗癌的表達降低，并且IRF1可以抑制舌鱗癌細胞的細胞生長活性并且增強其細胞凋亡。我們通過TargetScan預測并經熒光報告載體實驗驗證IRF1上游受miR-23a調控，miR-23a通過靶定IRF1的3‘UTR降低了IRF1的表達，同時在舌鱗癌組織中miR-23a表達明顯高于對應癌旁正常組織。

miRNA是非編碼RNA，長度為19-25個核苷酸。它是一種新型的基因表達調控分子，可以通過調控許多基因的表達來參與各種腫瘤的發生發展[8]。此前已有研究表明，部分miRNAs與OTSCC的發生發展密切相關[9]。microRNA-21和microRNA-375可以作為口腔鱗癌的生物標志物。miR-21可降低OTSCC細胞系中HPGD的表達，熒光素酶報告基因實驗證實了miR-21直接靶向HPGD mRNA。也證實了PGE2介導的miR-21的上調，提示OTSCC細胞中存在參與miR-21、HPGD和PGE2的正前饋環，有助于腫瘤的發生。miR-498和miR-940影響OTSCC細胞的侵襲和遷移能力[10]。而miR-101參與了舌鱗癌細胞的上皮間質轉化和腫瘤細胞轉移過程。hsa-miR-222通過直接順式調控機制(靶向MMP1 mRNA)和間接反式調控機制(靶向SOD2間接控制MMP1基因表達)調控MMP1表達。hsa-miR-222在OTSCC侵襲中發揮重要作用，可能成為轉移性疾病風險OTSCC患者新的治療靶點。

miR-23a直接和間接調控多種基因表達和信號轉導，介導腫瘤發生、腫瘤增殖、生存、細胞遷移和侵襲以及抗腫瘤治療的反應，在癌癥診斷、預后和治療應用中發揮重要作用。例如，肺癌患者血清中循環miR-23a水平升高，miR-23a水平與促血管生成活性呈正相關。結腸癌患者血清標本外泌體中miR-301a和miR-23a表達水平升高，可以作為結直腸癌早期檢測的非侵入性生物標志物[11]。在前列腺癌中，青藤堿通過抑制miR-23a的表達水平，進而前列腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲均受到抑制，同時細胞凋亡增加。然而，關于miR-23a在OTSCC中的表達及在OTSCC診斷中的意義的研究較少。

據報道，IRF1也可以通過結合其特定靶基因的啟動子來發揮其生物學功能。例如，IRF1可以結合ras相關基因RASSF5的啟動子，通過促進RASSF5表達下調RAS-RAC1通路從而抑制結直腸癌細胞的轉移和增殖。在結腸癌中，IRF1表達顯著降低，而且體外試驗表明IRF1抑制結腸癌細胞的增殖和遷移并且可以調節細胞的周期分布。在非小細胞肺癌中IRF1發揮潛在的抑癌作用，表皮生長因子和缺氧同時抑制IRF1的表達，且與其不良預后相關。在本研究中，我們發現12份OTSCC標本中，有11份標本的IRF1水平較正常對照顯著降低(P<0.001)。體外試驗表明，在OTSCC細胞中過表達IRF1后，細胞生長活性顯著降低，且細胞凋亡率增加。這些結果表明IRF1在OTSCC進程中起到抑制作用，這與IRF1在胰腺癌，乳腺癌，胃癌和前列腺癌中的表達模式一致[12,13]。

封閉miR-23a后，舌鱗癌細胞增殖和凋亡表型與過表達IRF1后表型改變一致。我們通過轉染miR-23a的反義寡核苷酸序列，封閉了舌鱗癌細胞中異常高表達的miR-23a，通過MTT實驗與TUNEL實驗檢測細胞的增殖與凋亡的改變，與過表達IRF1所得的表型改變一致。由于封閉了高表達的miR-23a，解除了對IRF1的抑制作用，相當于過表達了IRF1，故二者的細胞表型變化一致。

綜上，本研究表明IRF1在舌鱗癌的發生發展中起到抑癌基因的作用。IRF1上游受到miR-23a的調控，在OTSCC組織中miR-23a表達明顯升高，下調了IRF1的表達水平，從而促進了OTSCC細胞的增殖，抑制了細胞凋亡。