大蒜素調控PI3K/Akt/Nrf2通路對大鼠子宮內膜異位癥的影響

董秀娟， 曹若愚， 于洪基， 竇素棉

(河北省滄州市中心醫院產科， 河北 滄州 061000)

EMs是最常見的婦科疾病之一，與育齡期女性50%的不孕癥及80%的痛經有關，并且EMs作為一種良性疾病，卻具有惡性腫瘤般侵襲及遠處轉移的能力，給女性造成極大的生理和心理負擔[1]。EMs發病機制復雜，有研究發現腹腔局部乏氧及炎性微環境在EMs疾病進展過程中發揮著重要作用[2]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/核因子E2相關因子2(PI3K/Akt/Nrf2)通路對機體氧化應激和炎癥反應發揮著重要調控作用[3]。大蒜素是由百合科蔥屬植物大蒜的鱗莖中提取的一種二烯丙基三硫化物，具有抗炎、抗氧化、調節免疫力等多種藥理學作用[4]；并且大蒜素能夠通過調控PI3K/Akt通路抑制燒傷創面氧化應激和炎癥反應[5]。本研究通過自體內膜移植的方法制備大鼠EMs模型，探討大蒜素對EMs大鼠的治療作用以及對PI3K/Akt/Nrf2通路的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物:SPF級雌性SD大鼠45只，7周齡，體質量170g～200g，購自河北省實驗動物中心[實驗動物生產許可證號：SYXK(冀)2018-004]。分籠飼養于滄州醫學高等專科學校[實驗動物使用許可證號：SYXK(冀)2019-006]，飼養環境溫度23℃～25℃、相對濕度50%～70%、光照時間12h，實驗方案經滄州市中心醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2藥物與試劑:大蒜素注射液購自上海禾豐制藥有限公司(批號：20200416)；PI3K特異性抑制劑LY294002購自英國Abcam公司(批號：ab120725)；戊酸雌二醇片購自拜耳醫藥保健有限公司(批號：J20190812)。HE試劑盒購自河北博海生物有限公司(批號：20200104)；腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、干擾素γ(Interferon-γ，IFN-γ)酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(批號：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005、SEKRT-0008)；丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(批號：BC0020、SEKR-0073、BC0170、BC0200)；兔源Akt、磷酸化(p-Akt)、Nrf2、血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)、核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)、β-肌動蛋白(β-actin)抗體和羊抗兔IgG二抗購自北京博奧森生物科技有限公司(bsm-52010R、bsm-52129R、bs-1074R、bs-23397R、bs-23217R、bs-0061R、bs-0295G)；ECL超敏發光試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(批號：SW2030)。

1.3主要儀器:Vevo2100型小動物超聲儀(加拿大Visual Sonics公司)；UV2000型分光光度計(上海尤尼柯公司)；Varioskanlux型多功能酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；RM2125型石蠟切片機(德國Leica公司)；AI09型光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；VE180型電泳槽、VE186型轉膜儀(上海天能科技有限公司)；GelDoc2000 凝膠成像系統(美國 Bio-Rad公司)。

1.4方 法

1.4.1EMs大鼠模型制備:取35只實驗用大鼠，參照文獻[6]報道的自體內膜移植法制備EMs大鼠模型：造模前3d開始1次/d灌胃給予戊酸雌二醇(0.1mg/kg)，以調節大鼠動情周期使其同時發情；腹腔注射10%水合氯醛(3.5mL/kg)實施麻醉后，于尿道上端約2cm處開腹、暴露左側子宮，結扎左側子宮角并剪取約1cm長度的子宮，置生理鹽水中并剪成0.5cm×0.5cm子宮內膜組織塊，將其移植到右側腹壁皮下筋膜層、腹壁肌層之間，逐層縫合，常規飼養；假手術組行模型組相同的手術通路、結扎并切除左側子宮角，但不進行自體移植。4周后，通過小動物超聲儀檢測，腹壁下方可見暗灰色低回聲區，即為異位病灶，病灶內黑色無回聲區則提示病灶內有液體，通過圖像分割測量異位病灶體積≥50mm3，則認為造模成功(圖1)。

圖1 EMs模型大鼠異位病灶超聲檢查結果

1.4.2分組與給藥:取30只模型大鼠按照隨機數字表法分為模型組，大蒜素組和大蒜素+LY294002組；另10只大鼠設為假手術組。大蒜素組腹腔注射給予10mg/kg的大蒜素溶液(根據臨床人有效劑量折算大鼠用量)，大蒜素+LY294002組腹腔注射給予10mg/kg的大蒜素溶液加40mg/kg的LY294002溶液，假手術組和模型組腹腔注射給予生理鹽水，腹腔注射體積均為5mL/kg，給藥頻次均為1次/d，療程4周。

1.4.3子宮內膜異位病灶體積的測量及盆腔粘連評分:末次給藥6h后，實施麻醉后開腹，取假手術組大鼠在位子宮內膜組織及其它組大鼠內膜異位病灶，用生理鹽水沖洗干凈后，通過卡尺測量異位病灶的長(mm)、寬(mm)、高(mm)，然后按橢球體積計算公式計算病灶體積(V)，V(mm3)=0.52×長×寬×高；根據Haber評分法進行異位病變的盆腔粘連評分。

1.4.4HE染色法行子宮內膜組織病理學檢查:取部分在位(假手術組)子宮內膜組織或子宮內膜異位病灶組織，置4%多聚甲醛溶液72h后，依次進行常規石蠟包埋、5μm厚度切片、梯度乙醇脫蠟水化后行HE染色，用中性樹脂封片后通過光學顯微鏡觀察子宮內膜組織或內膜異位病灶組織病理學改變。

1.4.5ELISA法檢測子宮內膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量:取部分在位(假手術組)子宮內膜組織或子宮內膜異位病灶組織，在冰上剪碎后勻漿，4℃、3000rpm離心10min后取上清液，然后按照ELISA試劑盒說明檢測子宮內膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量。

1.4.6生化分析法檢測子宮內膜組織中MDA含量和MPO、SOD、CAT活力:取“1.4.5”制備的組織勻漿上清液，按照試劑盒說明檢測子宮內膜組織中MDA含量和MPO、SOD、CAT活力。

1.4.7Western blot法檢測子宮內膜組織Akt、p-Akt、Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表達:取每只大鼠約50mg在位子宮內膜組織或子宮內膜異位病灶組織，加入4℃預冷裂解液后勻漿，冰上靜置30min提取總蛋白，4℃、12000rpm離心20min后取上清液，BCA法檢測總蛋白濃度，每孔等量上樣后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉PVDF膜，加5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2h，洗膜后滴加Akt(1∶1000)、p-Akt(1∶1000)、Nrf2(1∶800)、HO-1(1∶1000)、NF-κB(1∶1000)、β-actin(1∶3000)抗體4℃孵育過夜，洗膜后滴加IgG二抗(1∶5000)室溫孵育1.5h，洗膜后滴加ECL后通過凝膠成像系統顯示蛋白條帶，以目標蛋白條帶灰度值與β-actin(內參)條帶灰度值的比值半定量目標蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1大蒜素對EMs大鼠子宮內膜異位病灶體積和盆腔粘連評分的影響:與模型組相比，大蒜素組和大蒜素+LY294002組子宮內膜異位病灶體積明顯縮小、盆腔粘連評分降低(P<0.05)；與大蒜素組比較，大蒜素+LY294002組異位病灶體積增大、盆腔粘連評分升高(P<0.01)，見表1。

表1 大蒜素對EMs大鼠子宮內膜異位病灶體積和盆腔粘連評分的影響±s)

2.2大蒜素對EMs大鼠子宮內膜病理學改變的影響:假手術組在位子宮內膜柱狀上皮細胞和間質細胞排列整齊、致密；模型組子宮內膜異位病灶柱狀上皮細胞排列整齊、間質細胞致密、新生血管明顯增生等病理學改變；大蒜素組上皮細胞脫落、間質疏松、新生血管明顯減少；與大蒜素組比較，大蒜素+LY294002組上皮細胞脫落、間質疏松程度加重，新生血管明顯增多。見圖2。

圖2 大蒜素對EMs大鼠子宮內膜病理學改變的影響(HE染色，×200倍)注：A.假手術組；B.模型組；C.大蒜素組；D.大蒜素+LY294002組

2.3大蒜素對EMs大鼠子宮內膜組織TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量的影響:與假手術組在位子宮內膜相比，模型組子宮內膜異位病灶TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量升高(P<0.01)；與模型組相比，大蒜素組子宮內膜異位病灶TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量降低(P<0.05或P<0.01)；與大蒜素組相比，大蒜素+LY294002組TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量降低(P<0.01)。見表2。

表2 大蒜素對EMs大鼠子宮內膜組織TNF-α IL-1β IL-6 IFN-γ含量的影響 ±s)

2.4大蒜素對EMs大鼠子宮內膜組織MDA含量和MPO、SOD、CAT活力的影響:與假手術組在位子宮內膜相比，模型組子宮內膜異位病灶MDA含量升高而MPO、SOD、CAT活力降低(P<0.01)；與模型組相比，大蒜素組和大蒜素+LY294002組子宮內膜異位病灶MDA含量降低且MPO、SOD、CAT活力升高(P<0.05或P<0.01)；與大蒜素組相比，大蒜素+LY294002組MDA含量降低且MPO、SOD、CAT活力升高(P<0.01)。見表3。

表3 大蒜素對EMs大鼠子宮內膜組織MDA含量和MPO SOD CAT活力的影響±s)

2.5大蒜素對EMs大鼠子宮內膜組織Akt、p-Akt、Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表達的影響:與假手術組在位子宮內膜相比，模型組子宮內膜異位病灶p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白表達下調且p-Akt/Akt降低(P<0.01)，NF-κB蛋白表達上調(P<0.01)，Akt表達差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組相比，大蒜素組和大蒜素+LY294002組子宮內膜異位病灶p-Akt、Nrf2、HO-1表達上調且p-Akt/Akt升高(P<0.01)，NF-κB表達下調(P<0.01)，Akt表達差異無統計學意義(P>0.05)；與大蒜素組相比，大蒜素+LY294002組Nrf2、HO-1蛋白表達下調且p-Akt/Akt降低(P<0.01)，NF-κB表達上調(P<0.01)，Akt表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、表4。

圖3 大蒜素對EMs大鼠子宮內膜組織Akt、p-Akt、Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表達的影響注：A.假手術組；B.模型組；C.大蒜素組；D.大蒜素+LY294002組

表4 大蒜素對EMs大鼠子宮內膜組織Akt p-Akt Nrf2 HO-1 NF-κB蛋白表達及p-Akt/Akt的影響±s)

3 討 論

EMs是育齡期女性常見的婦科疾病之一，發病率約10%，病程反復、遷延難愈，是導致痛經、盆腔痛甚至不孕的重要原因[7]。病理生理學研究發現，氧化應激和炎癥反應能夠促進子宮內膜細胞在腹腔黏附與生長，在EMs的發生發展過程中發揮重要作用[8,9]。

在中醫EMs屬“痛經”、“癥瘕”、“月經病”、“不孕”等范疇，瘀血阻滯、氣血運行不暢是EMs的重要病理機制。大蒜為百合科蔥屬植物，其鱗莖可入藥，性溫、味辛甘，大蒜素是其主要活性成分，具有活血化瘀、益氣解毒、宣通溫補之功效。大鼠具有飼養成本低、動情周期短、自發排卵等特點，移植造模法主要分為自體、同種異體、異種異體移植法，其中自體移植法具有與人體EMs病理特點接近、異位灶種植部位準確等優勢。本研究采用自體移植法制備EMs大鼠模型并給予大蒜素進行治療，結果顯示，經大蒜素治療后EMs大鼠異位病灶明顯縮小，粘連評分降低，異位病灶上皮細胞呈現脫落、間質疏松且新生血管明顯減少，異位病灶中炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量明顯降低，抗氧化酶MPO、SOD、CAT活力明顯升高且MDA含量明顯降低，提示大蒜素對大鼠EMs具有一定的治療作用，其機制可能與抑制炎癥反應和氧化應激有關。

PI3K/Akt/Nrf2通路是細胞內重要信號轉導通路之一，在細胞氧化應激和炎癥反應過程中發揮著重要的調控作用。PI3K由脂類和絲氨酸/蘇氨酸激酶組成，屬脂質激酶家族成員，是細胞內信號轉導的第二信使。Akt是PI3K下游信號分子和靶激酶，能夠被PI3K誘導磷酸化(p-Akt)而被激活。p-Akt誘導Nrf2與Kelch樣ECH關聯蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein，Keap1)解離并促進Nrf2核轉位，然后與抗氧化響應元件(Antioxidant response element，ARE)結合而誘導抗氧化酶(SOD、CAT等)和HO-1轉錄表達，進而抑制氧化應激反應和線粒體損傷[10]。NF-κB核轉位后能夠誘導炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等合成與釋放，抑制NF-κB表達則能夠明顯抑制細胞炎癥反應，而HO-1對NF-κB表達與核轉位具有抑制作用。本研究發現，經大蒜素治療能夠明顯上調EMs大鼠異位病灶p-Akt、Nrf2、HO-1表達并提高Akt磷酸化比率(p-Akt/Akt)，下調NF-κB表達。此外，LY294002是一種具有細胞滲透性的小分子物質，作用于酶的ATP結合位點，是P13K的高效選擇性抑制劑，本研究發現，LY294002能夠部分逆轉大蒜素降低EMs大鼠異位病灶體積和粘連評分、抑制氧化應激和炎癥反應、調節PI3K/Akt/Nrf2通路相關蛋白表達的作用。提示大蒜素對大鼠EMs的治療作用可能與激活PI3K/Akt/Nrf2通路有關。

綜上所述，大蒜素對大鼠EMs具有一定的治療作用，其作用機制可能與激活PI3K/Akt/Nrf2通路，進而抑制炎癥反應和氧化應激有關。本研究結果為大蒜素做為EMs治療提供了理論支持。