丙泊酚對二氧化碳氣腹大鼠肝功能及HMGB1/TLR4信號通路的影響

艾 玲， 徐 卉， 陳 昊

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院麻醉科， 湖北 武漢 430030)

腹腔鏡手術因其創傷小、操作精細、恢復快等特點而為外科手術的革新指明了方向，并得到廣泛的應用，但腹腔鏡手術中所需的二氧化碳氣腹會對患者肝腎功能產生影響，目前研究發現，氣腹引起的腹內壓升高、肝血流改變是造成肝損傷及肝功能改變的主要原因[1]。近來研究發現，多種原因所致肝損傷均可引起高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein box 1，HMGB1)大量釋放，并介導Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)通路釋放炎癥因子，在多種肝臟疾病中發揮重要作用[2]。然而在氣腹引起的肝損傷過程中，HMGB1/TLR4通路的調控作用研究較少。丙泊酚可用于全身麻醉的誘導和維持，近來有文獻報道丙泊酚不僅可改善肝臟缺血再灌注損傷[3]，還可在腹腔鏡直腸癌根治術中降低患者血清炎癥因子水平，發揮抗炎作用[4]。但丙泊酚對氣腹所致肝臟損傷的改善作用未見報導?；诒捶訉Ω闻K的保護作用及在腹腔鏡手術中的抗炎作用，本研究推測丙泊酚可能對氣腹引起的肝損傷有緩解效果，并建立大鼠氣腹模型對此進行驗證，以期闡明丙泊酚發揮肝損傷保護的可能機制。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1動物:60只6～7周齡清潔級SD雄性大鼠，體重200～220g，由華中科技大學實驗動物中心提供[生產許可證號為SCXK(鄂)2019-0002]，大鼠在溫度23～26℃，濕度45～55%的環境中飼養。本實驗經醫院倫理委員會批準同意。

1.1.2主要藥品、試劑及儀器:丙泊酚注射液(批號20210109，規格200mg，西安力邦制藥有限公司)；聯苯雙酯片(批號20201229，規格25mg，北京太洋藥業股份有限公司)；大鼠天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號MM-21301R1、MM-3057R，武漢益普生物科技有限公司)；白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(批號DM-M57136、DM-M71138，上海篤瑪生物科技有限公司)；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒(批號P0027、CL-80064，上海碧云天公司)；HMGB1、TLR4、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、干擾素-γ(IFN-γ)、β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(批號ab18256、ab217274、ab7202、ab171081、ab53013、ab10357，美國abcam公司)；羊抗兔二抗(批號AT01C9，深圳市安提生物科技有限公司)等；全自動氣腹機(型號F25，武漢國惠醫療設備有限公司)；酶標儀(型號MB16-414，上海勝衛電子科技有限公司)；光學顯微鏡、全自動化學發光儀(型號SMZ745、CC600，上海寰熙醫療器材有限公司)等。

1.2方 法

1.2.1模型建立及分組給藥:3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，參照文獻[5]方法將氣腹針插入腹腔內1cm，連接氣腹機，加壓力為20mmHg的二氧化碳，持續時間2h，建立氣腹模型。待大鼠蘇醒后，取大鼠腹主動脈血，用ELISA檢測大鼠血清肝功能指標AST、ALT水平(高于手術前2～3倍)，視為造模成功(共50只)，隨機分為氣腹組、丙泊酚低、中、高劑量組、陽性對照組，每組10只。另取10只健康大鼠除不建立氣腹外，其余操作同上，作為假手術組。各組均于術后2h開始給藥，丙泊酚參照文獻[6]設置低、中、高劑量(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)，用生理鹽水稀釋成濃度為0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL的溶液，按10mL/kg劑量經腹腔注射給藥；陽性對照組參照文獻[7]設置劑量灌胃給予25mg/kg的聯苯雙酯溶液(生理鹽水稀釋成2.5mg/mL的溶液，10mL/kg劑量灌胃給藥)；假手術組與氣腹組經腹腔注射等量生理鹽水；給藥10h后取材，進行后續試驗。

1.2.2肝功能檢測:給藥10h后，麻醉取大鼠腹主動脈血5mL，離心取上清液，檢測血清AST、ALT水平。

1.2.3肝組織病理學觀察:頸脫臼處死大鼠，摘取大鼠肝臟，取部分肝臟置于-80℃保存備用；剩余部分肝臟于4%多聚甲醛中固定24h，制成厚為5μm的石蠟切片，取部分切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色，于光鏡下觀察肝臟病理變化。

1.2.4ELISA法檢測肝組織IL-6、TNF-α水平:取-80℃保存的肝臟組織，解凍、勻漿、離心后取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測炎癥因子指標IL-6、TNF-α水平。

1.2.5蛋白免疫印跡法檢測肝組織HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表達:取冰凍肝臟組織勻漿液，提取蛋白，BCA法測蛋白總濃度，取100μg蛋白行電泳及轉膜，滴加1∶1000的一抗(HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ)抗體及1∶2000的β-actin內參抗體4℃孵育24h，加入1∶2000的羊抗兔二抗室溫孵育1h，增強化學發光法顯色，Image-J軟件分析條帶相對表達。

2 結 果

2.1各組大鼠給藥后血清肝功能指標AST、ALT檢測結果:與假手術組相比，氣腹組大鼠血清AST、ALT水平升高(P<0.05)；與氣腹組相比，丙泊酚各劑量組及陽性對照組大鼠血清AST、ALT水平降低(P<0.05)，且血清AST、ALT水平隨丙泊酚劑量增加依次降低(P<0.05)；與丙泊酚高劑量組相比，陽性對照組大鼠血清AST、ALT水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清AST ALT水平比較±s，n=10)

2.2各組大鼠肝組織HE染色結果:假手術組大鼠肝組織結構完整，未見明顯損傷；氣腹組大鼠可見肝小葉結構紊亂，肝細胞炎性浸潤及片狀壞死現象明顯；丙泊酚各劑量組大鼠肝細胞腫脹、變性、壞死等病理損傷程度依次減輕。見圖1。

圖1 HE染色檢測大鼠肝組織病理損傷(×400)

2.3各組大鼠肝組織IL-6、TNF-α水平檢測結果:與假手術組相比，氣腹組大鼠肝組織IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；與氣腹組相比，丙泊酚各劑量組及陽性對照組大鼠肝組織IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)，且肝組織IL-6、TNF-α水平隨丙泊酚劑量增加依次降低(P<0.05)；與丙泊酚高劑量組相比，陽性對照組大鼠肝組織IL-6、TNF-α水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝組織IL-6 TNF-α水平比較±s，n=10)

2.4各組大鼠肝組織HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表達結果:與假手術組相比，氣腹組大鼠肝組織HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表達升高(P<0.05)；與氣腹組相比，丙泊酚各劑量組及陽性對照組大鼠肝組織HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表達降低(P<0.05)，且肝組織HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表達隨丙泊酚劑量增加依次降低(P<0.05)；與丙泊酚高劑量組相比，陽性對照組大鼠肝組織HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠肝組織HMGB1、TLR4、MCP-1、ICAM-1、IFN-γ蛋白印跡圖注A：假手術組；B：氣腹組；C：丙泊酚低劑量組；D：丙泊酚中劑量組；E：丙泊酚高劑量組；F：陽性對照組

表3 各組大鼠肝組織HMGB1 TLR4 MCP-1 ICAM-1 IFN-γ蛋白相對表達水平比較±s，n=10)

3 討 論

隨著腹腔鏡手術在外科診斷和治療中的應用，其手術中氣腹所致臟器損傷逐漸成為急需解決的問題[8]。鄒海波等[5]研究發現氣腹壓力20mmHg持續1h后，解除氣腹壓力可導致肝臟缺血灌注再損傷及肝功能指標ALT、AST水平高于正常值2倍以上，表明給予大鼠氣腹壓力持續一定時間可建立肝臟損傷模型。本研究給予大鼠氣腹壓力20mmHg持續2h建立氣腹模型，給藥10h后，氣腹組大鼠血清ALT、AST水平高于假手術組大鼠6倍以上，且HE染色可見肝細胞大量壞死和變性，提示氣腹模型大鼠肝組織及功能受損，表明造模成功。

目前，維持最低限度氣腹壓力、使用氯胺酮等麻醉藥物是減少腹腔鏡手術中氣腹對肝損傷的主要措施，雖能在一定程度上預防氣腹引起的肝損傷，但特異性及防治效果欠佳[9]。丙泊酚是一種全身麻醉藥，可應用于多種手術的麻醉和鎮靜，另外，有文獻[10]報道丙泊酚可有效緩解肝臟損傷。故本研究推測丙泊酚可能對氣腹引起的肝損傷有一定保護作用，并建立氣腹肝損傷大鼠模型對此進行驗證，發現給予氣腹肝損傷大鼠丙泊酚低、中、高劑量及陽性藥物治療后，丙泊酚低、中、高劑量組及陽性對照組大鼠肝組織細胞壞死和變性現象明顯緩解，血清ALT、AST水平均顯著低于氣腹組大鼠，提示丙泊酚可改善氣腹肝損傷大鼠肝功能及病理損傷。

HMGB1含量對肝損傷診斷及預后有重要的診斷及預測作用[11]。袁蘇榆等[12]研究發現，對過量乙酰氨基酚所致急性肝功能衰竭患者血清HMGB1水平迅速升高，且早于ALT等肝功能指標變化，表明HMGB1水平更能及時靈敏地診斷出藥物所致肝損傷。HMGB1不僅可由壞死細胞被動釋放，還可由活化的單核、巨噬等免疫細胞釋放，通過與TLR4受體結合將其激活，活化的TLR4可誘導炎性細胞因子和趨化因子聚集，促進肝臟發生炎性損傷和纖維化，導致肝功能衰竭[13]；還可刺激IFN-γ表達進一步促進HMGB1的釋放[14]。另外活化單核細胞產生的IL-6、TNF-α也可誘導MCP-1、ICAM-1等多種趨化分子及粘附分子表達釋放，促進血管內皮細胞粘附，進而加重組織損傷[15]。本研究發現，氣腹組大鼠肝組織中HMGB1、TLR4、IFN-γ、MCP-1、ICAM-1蛋白及IL-6、TNF-α水平均明顯高于假手術組，提示氣腹肝損傷大鼠肝組織中HMGB1/TLR4通路處于活化狀態，推測HMGB1/TLR4通路活化誘導炎性細胞因子和趨化因子聚集，可能是氣腹導致肝臟損傷的主要病理機制。而丙泊酚各劑量組及陽性對照組肝組織HMGB1、TLR4、IFN-γ、MCP-1、ICAM-1蛋白及IL-6、TNF-α水平均明顯低于氣腹組，提示丙泊酚及陽性藥物治療后，HMGB1/TLR4通路活化程度較低，炎性因子水平較低，表明丙泊酚降低氣腹大鼠肝臟損傷的作用可能與抑制HMGB1/TLR4通路有關。

綜上所述，丙泊酚可抑制HMGB1/TLR4通路激活，降低肝組織炎癥因子及趨化因子表達，緩解氣腹大鼠肝臟損傷，可能為丙泊酚在腹腔鏡手術中應用提供一定參考。但腹腔手術中氣腹引起肝損傷的分子機制較為復雜，HMGB1/TLR4信號轉導通路的下游靶基因較多，丙泊酚也可能通過其他途徑改善腹腔手術中氣腹引起的肝損傷，有待后續進一步驗證。