骨髓間充質干細胞外泌體miR-25-3p調控骨肉瘤細胞增殖遷移及侵襲能力的功能與機制研究

劉漢濤， 趙良虎， 秦宏敏

(攀枝花學院附屬醫院骨科， 四川 攀枝花 617099)

骨肉瘤是一類常發病于青少年或兒童膝關節周圍的原發性惡性腫瘤[1]，具有高侵襲性和高轉移性。據統計，世界范圍內骨肉瘤的發病率正在逐漸增加。目前骨肉瘤的主要治療方法有化療和手術切除，但是治療效果并不十分理想，仍然存在嚴重的遠端轉移以及腫瘤復發，所以需要探究更多的骨肉瘤的發展機制[2]。骨髓間充質干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSC)是一類多能干細胞，存在于骨髓基質中，可分化為成骨細胞以及脂肪細胞，可轉移至腫瘤組織而調控腫瘤進程[3]。間充質干細胞外泌體是一類由間充質干細胞分泌的納米級囊泡，可攜帶間充質干細胞的遺傳信息，如miRNA、lncRNA、脂質等[4]，研究表明BMSC exo可促進多種腫瘤的進程，例如，缺氧條件下BMSC exo miRNA通過STAT3誘導的EMT而促進肺癌的轉移[5]。MiRNA-25-3p已經被報道可調控多種腫瘤的病理進程，例如，外泌體MiR-25-3p可誘導腫瘤血管形成以及腫瘤轉移前腫瘤微環境的形成，亦可促進乳腺癌的生長和轉移[6]。然而BMSC exo中miR-25-3p是否對骨肉瘤的發生發展產生影響及機制尚無報道，本研究旨在闡明BMSC exo中miR-25-3p對骨肉瘤生長和轉移的作用，并深入探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料:骨髓間充質干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSC)(購自廣州賽業生物科技有限公司)，骨肉瘤細胞MG-63(購自中科院上海細胞庫)，Lipofectamine 2000 轉染試劑(購自美國Thermo Fisher Scientific公司)，miRNA逆轉錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒(購自美國Thermo Fisher Scientific公司)，Trizol試劑盒(購自上海聯邁生物工程有限公司)，CD29-APC、CD90-FITC、CD45-PE、PTEN、GAPDH、CD9、CD63、TSG101抗體(購自美國Cell Signaling Technology公司)，CCK8試劑盒(購自英國Abcam公司)，RIPA試劑盒(購自沈陽萬類生物技術有限公司)。

1.2細胞培養:BMSC培養于含10%FBS、10ng/mL bFGF、20μg/mL Vitamin C的DMEM/F12培養基中，MG-63培養于含10%FBS的DMEM培養基中，細胞培養于5% CO2、37℃的細胞培養箱中，隔天更換培養基，培養至細胞匯合率80%時進行細胞傳代。

1.3細胞分組與轉染:BMSC分為miR-NC組和miR-25-3p組(轉染miR-25-3p mimic Negative Control和miR-25-3p mimic)。提取miR-NC組和miR-25-3p組BMSC分泌的外泌體記為miR-NC exo和miR-25-3p exo。MG-63分為miR-NC組和miR-25-3p組(轉染miR-25-3p mimic Negative Control和miR-25-3p mimic)，PBS組和BMSC exo組(MG-63與PBS以及10μg/mL的BMSC exo共孵育48h)，miR-NC exo組、miR-25-3p exo組(分別與10μg/mL的miR-NC exo和miR-25-3p exo共孵育48h)以及miR-25-3p exo+PTEN組(與10μg/mL miR-25-3p exo共孵育48h后轉染PTEN質粒)。按照上述分組使用Lipofectamine 2000 轉染試劑進行轉染，qRT-PCR鑒定轉染效果。

1.4外泌體的提取與鑒定:將各組BMSC培養基更換為含10%無外泌體FBS的培養基，培養48h后取上清，使用差速離心法提取外泌體，300g離心10min，取上清，2000g離心10min，取上清，10000g離心70min，取上清，100000g離心70min，收集沉淀，PBS重懸后繼續100000g離心70min以清洗外泌體，收集沉淀后用100μL無菌PBS重懸。透射電鏡觀察外泌體的結構，Western blot鑒定外泌體標志蛋白CD9、CD63、TSG101。

1.5qRT-PCR:Trizol試劑盒提取各組細胞的總RNA，使用核酸定量儀進行核酸定量，根據逆轉錄試劑盒取1μg的RNA逆轉錄為cDNA，根據qRT-PCR試劑盒進行PCR擴增反應，反應條件為：95℃預變性30s，95℃ 5s，60℃ 30s，共40個循環，數據處理采用 2-ΔΔCt法，計算miR-520a-3p 表達的水平。引物序列如下：

miR-25-3p-F:5’-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3’

miR-25-3p-R:5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’

U6-F:5’ -CTCGCTTCGGCAGCACA-3’

U6-R:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

1.6CCK8法檢測細胞增殖:將轉染后以及與外泌體共孵育后的MG-63細胞接種至96孔板中，每孔5000個細胞，每孔100μL，分別于培養0、24、48、72h，取出對應的96孔板，每孔加入10μL的CCK8溶液，混合均勻后使用酶標儀在450nm處檢測各組細胞吸光度(OD)值。

1.7Transwell小室法檢測細胞遷移和侵襲:取轉染或與外泌體孵育后的MG-63細胞用DMEM空白培養基稀釋后接種于Transwell小室中(或鋪Matrigel膠的Transwell小室)，每孔接種1×104個細胞，小室放置于24孔板中，24孔板每孔加入含10%FBS的DMEM 600μL，然后繼續培養72h后，小室用PBS清洗后用無水甲醛固定30min，底部滴加結晶紫溶液染色10min，清洗后于顯微鏡下觀察拍照。

1.8雙熒光素酶報告基因實驗:TargetScan數據庫預測PTEN與miR-25-3p結合位點，將PTEN野生型(pGL3-PTEN WT組)、突變型質粒(pGL3-PTEN MUT組)以及空白質粒(pGL3-control組)，使用Lipofectamine 2000將上述質粒轉染至293T，用Lipofectamine 2000 轉染試劑將miR-25-3p mimic和miR-NC轉染至上述293T細胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光強度。

1.9Western blot:取各組6孔板中培養的MG-63，加入200μL RIPA，裂解30min，12000×rpm，離心15min，取上清液為細胞總蛋白，取10μg蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后轉膜，封閉2h，PVDF膜與PTEN、CD9、CD63、TSG101、GAPDH抗體4℃過夜孵育，TBST洗膜后，二抗室溫孵育1.5h，洗膜后用ECL試劑盒顯影，拍照，用Image J軟件對曝光結果進行定量分析。

1.10統計學分析:采用SPSS22.0軟件進行統計分析。所有數據以均值±標準差表示，多組間差異使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較采用LSD-t檢驗法。P<0.05為差異具有統計學意義

2 結 果

2.1外泌體鑒定結果:本文所提取的BMSC exo粒徑在100nm左右，具有雙層膜結構，形態呈“杯托”樣，并且表達外泌體標志蛋白CD9、CD63、TSG101，符合外泌體的結構及生物學特征(圖1)。

圖1 透射電鏡(A)和Western blot(B)鑒定外泌體結果

2.2miR-25-3p促進骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲:相比于miR-NC組，miR-25-3p mimic組MG-63細胞OD值在24h、48h、72h均顯著增加(P<0.05)，細胞遷移和細胞侵襲數目亦顯著增加(P<0.001)，說明miR-25-3p顯著促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力(圖2)。

圖2 miR-25-3p對骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力的影響A：CCK8法檢測細胞增殖能力；B：Transwell小室法檢測細胞遷移和侵襲能力(×20倍)相比于miR-NC組，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3間充質干細胞外泌體促進骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲:相比于PBS組，BMSC exo組MG-63細胞OD值均顯著增加(P<0.05)，MG-63細胞遷移數和細胞侵襲數亦顯著增加(P<0.001)，說明BMSC exo可顯著促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力(圖3)。

圖3 間充質干細胞外泌體對骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響A：CCK8法檢測細胞增殖能力；B：Transwell小室法檢測細胞遷移和侵襲能力(×20倍)相比于PBS組，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.4間充質干細胞外泌體轉移miR-25-3p至骨肉瘤細胞:相比于PBS組，BMSC exo組MG-63細胞miR-25-3p表達顯著上調(P<0.001)(圖4A)，miR-25-3p exo中miR-25-3p表達顯著高于miR-NC exo(P<0.001)(圖4B)，而miR-25-3p exo組MG-63細胞中miR-25-3p表達顯著高于miR-NC exo組(P<0.001)(圖4C)，說明間充質干細胞外泌體可轉移miR-25-3p至骨肉瘤細胞。

圖4 間充質干細胞外泌體轉移miR-25-3p至骨肉瘤細胞A,C：qRT-PCR檢測細胞中miR-25-3p表達；B：qRT-PCR檢測外泌體中miR-25-3p表達 相比于PBS組/miR-NC exo/ miR-NC exo組，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.5PTEN為miR-25-3p靶基因:TargetScan數據庫預測PTEN和miR-25-3p結合位點如圖5A所示，雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，PTEN-WT組細胞轉染miR-25-3p mimic后，相對熒光強度顯著低于miR-NC組(P<0.001)，而PTEN-MUT組細胞轉染miR-25-3p mimic和miR-NC后細胞相對熒光強度無顯著差異，證明PTEN為miR-25-3p靶基因(圖5B)。miR-25-3p mimic組MG-63細胞PTEN表達水平顯著低于miR-NC組(P<0.001)(圖5C)，miR-25-3p exo組MG-63細胞PTEN表達水平顯著低于miR-NC exo組(P<0.001)(圖5D)，說明外泌體miR-25-3p可顯著抑制PTEN表達。

圖5 miR-25-3p對PTEN表達的調控A：數據庫預測miR-25-3p與PTEN結合位點；B：雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-25-3p與PTEN結合位點；C,D：Western blot檢測各組細胞PTEN蛋白表達相比于miR-NC組或miR-NC exo組，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.6外泌體miR-25-3p靶向PTEN促進骨肉瘤的增殖、遷移和侵襲:相比于miR-NC exo組，miR-25-3p exo組MG-63細胞24h、48h、72h MG-63細胞OD值顯著增加(P<0.05)，細胞遷移和侵襲數顯著增加(P<0.001)，說明BMSC exo能夠顯著促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。而miR-25-3p exo+PTEN組MG-63細胞OD值、細胞遷移和侵襲數顯著低于miR-25-3p exo組(P<0.05)，說明外泌體miR-25-3p通過抑制PTEN表達而影響骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力(圖6)。

圖6 外泌體miR-25-3p對骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響A：CCK8法檢測細胞增殖能力；B：Transwell小室法檢測細胞遷移和侵襲能力(×20倍)相比于PBS組，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討 論

腫瘤的生長和轉移受多種機制的調控，包括血管新生、免疫逃逸、侵襲和轉移能力等[7]。研究表明[8]，腫瘤的生物學功能不僅與腫瘤細胞自身有關，還與腫瘤微環境中的非腫瘤細胞相關，間充質干細胞是重要的非腫瘤細胞之一，間充質干細胞及其分化的基質細胞在腫瘤的發生發展中發揮重要的功能。研究表明[9]，實體瘤組織中可分離出BMSC，腫瘤組織中的BMSC與正常組織中的間充質干細胞具有相同的形態、表型以及分化能力，但是其生物學功能亦有顯著差異。腫瘤中BMSC可分化為腫瘤相關成纖維細胞，而誘導血管內皮生長因子、轉化生長因子-β、白介素-10等細胞因子的分泌而促進腫瘤的生長和轉移。研究表明[10]，BMSC可通過激活Jagged1/Notch1信號通路而促進前列腺的細胞干性。但是BMSC對骨肉瘤的生長和轉移的影響及機制尚無研究。

外泌體是一類由多種活細胞分泌的納米級囊泡，研究表明，人BMSC外泌體可促進前列腺癌的發生發展[11]，亦可通過激活PI3K/AKT信號通路而促進頭頸癌的病理進程[12]。本文提取并鑒定了BMSC外泌體，并且發現BMSC exo可促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，說明BMSC exo可促進骨肉瘤的生長和轉移能力。

外泌體內含多種遺傳物質包括miRNA、lncRNA、circRNA等，間充質干細胞外泌體可攜帶間充質干細胞的遺傳物質，如miRNA等。間充質干細胞外泌體miRNA有望成為腫瘤治療的新靶點。MiR-25-3p被報道可調控多種腫瘤的發生發展，例如，外泌體miR-25-3p和miR-92a-3p可促進脂肪肉瘤的進程[13]，循環miR-25-3p作為新的骨肉瘤診斷和預后生物標志物[14]。本研究發現，過表達miR-25-3p后骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著增加，說明miR-25-3p可促進骨肉瘤的生長和轉移。

miRNA對靶基因的調控表現在轉錄后水平上，通過對靶基因mRNA的切割或對其翻譯抑制兩種機制來下調靶基因的表達，在哺乳動物細胞中，miRNA可結合于靶基因mRNA的3’UTR區域，而抑制靶基因的翻譯[15]。雙熒光素酶報告基因實驗檢測發現，PTEN為miR-25-3p的靶基因，MiR-25-3p以及BMSC exo中的miR-25-3p可抑制骨肉瘤細胞中PTEN的表達。本研究發現，外泌體可轉移miR-25-3p至骨肉瘤細胞，并且發現BMSC exo miR-25-3p可促進骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。而過表達PTEN后外泌體miR-25-3p對骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力的促進作用被顯著抑制，說明骨髓間充質干細胞外泌體miR-25-3p可靶向PTEN而促進骨肉瘤的生長和轉移，提示外泌體miR-25-3p或可作為骨肉瘤治療的新靶點。

綜上所述，骨髓間充質干細胞外泌體可轉移miR-25-3p至骨肉瘤細胞，并抑制其靶基因PTEN的表達而促進腫瘤的生長和轉移，但是骨髓間充質干細胞外泌體miR-25-3p是否能作為骨肉瘤治療的新靶點還需進一步探究。